После положительного пика выходят отрицательные (HPLC RI)

[Skistkin]

Доброго всем времени суток!

Пролема такова: после каждого выхода положетельного пика (любого моно- или дисахарида) через минуту появляется отрицательный пик, пропорциональный по высоте концентрации вещества. При этом отрицательные пики присутсвуют у всех низкомолекулярных сахаров. То есть на 3 вещества приходиться 3+1 положительных пика и 3+1 отрицательных (+1 это t0).
Появились эти пики после того, как купил новую колонку предназначенную для сахаров(Zorbax carbohydrate analysis). В старой колонке был только один отрицательный пик, который шел через пару минут после t0, но никак не после каждого соединения.

ПФ: 75% АCN 25%H2O.
Образец вначале был расторен в воде, потом в 50% на 50% ACN/H2O (как в спецификации), потом в подвижной фазе.

В подвижной фазе отрицательные пики от t0 пропали, но остались и не уменьшились отрицательные пики от сахаров, и все так же пропорциональны по высоте к положительным.
Сняв колонку и подключив напрямую к рефрактометру, никаких отрицательных пиков обнаружено не было.
Все дело в равновесии колонки?
Если так, что как долго эквилибрировать колонку что бы с ней можно было работать?

[Skistkin]

В файле две хроматограммы:
Первая со стандартами в мобильной фазе, а вторая просто бланк(вода). Как видно их хроматограм, негативные пики идут через 1,5 минуты (или 1 обьем колонки) после выхода положительных.

[StYV]

Странная история.
Сахара анализировали на амино-колонке и никаких проблем не возникало, причем детектор даже не термостатировали.
Здесь на стандартах в мертвом объёме пик отрицательный, при 3 мин - положительный, а при вколе воды картина совсем обратная. На стандартах отрицательные пики идут после 5.5 мин., а на воде их вообще нет.
Возьмите стандарты, воду и ацетонитрил из других источников - посмотрите изменится ли что-то.
С уважением StYV.

[Skistkin]

StYV, спасибо Вам за ответ.


Стандарты у меня от разных фирм, все равно негативные пики появляются.
Воду беру из университета (специально купили фильты для деионизатора), а вот ACN... Посмотрим что будет.


Кстати, я через колонну провел воду (0,5 ml/min) и тоже никаких негативных пиков однаруженно не было. Если бы смывалась колонка, то негативыне пики в большей степени появились бы именно там, а так как n(20)D у воды 1,333 а у ACN 1,344 - может все же дело в равновесии? Негатвыных пиков нет даже если убрать колонку и провести подвижную фазу (25:75 H2O:ACN), вводя в бланке воду.

И положительный пик при 3 минутах тоже вызывает недоумение.

[StYV]

Для Вашей колонки и скорости потока подвижной фазы время для мертвого объёма примерно 1.4 мин и пики в этом месте вполне возможны. Но вот пик при 3 мин не понятен, так и далее отрицательные пики. Что-то есть в реактивах или непонятная неисправность прибора. Возможно что-то с инжектором или при вколе.
При уравновешивании колонке видно когда она готова по дрейфу базовой линии. Возьмите покачайте часика 4-5 и потом колите.
Мой совет - позовите опытного хроматографиста, заочно давать советы это никчемное занятие.
С уважением StYV.

[styskin]

Воду... лучше купите бутылку архыза. AcN любой импортный берете.
Термостат ячейки лучше включить на 30 градусов и часа на два оставить, промывая при этом ячейку сравнения. Ну и колонку желательно термостатировать при тридцаточке.
Еще без колонки инжектор в положении load и inject последовательно промыть AcN и водой (кипяток!) большими обьемами...
Ну и шприц тоже промыть тем же. Думаю все исчезнет после этих танцев))

[Deminolog]

А если в университете стоит Milli-Q в хорошем состоянии или обычный стеклянный бидистиллятор, за которым также ухаживают, по-моему, это будет намного лучше архыза
Главное, какая бы это вода ни была, чтобы она не была столетней давности... Вода для ПФ всегда должна быть свежей, никак иначе...

[Skistkin]

Добрый день, товарищи!
Спасибо всем за ответы.
Причина негативных пиков найдена.

Дело в том, что в ячейке образовалось высокое давление из за чего открыт клапан, который открывается только при промывке ячейки сравнения (purge). То есть при низких скоростях (или разделив поток, как мы и сделали) негативных пиков обнаружено не было.

[Виктория М.]

А что делать, если выходят не только отрицательные пики, но также базовая линия падает, так что похожа на кардиограмму? При этом прибор (хроматограф thermo ultimat 3000) промывался водой и органическими растворителями перед испытанием. Хроматограммы не обсчитываемы вообще.

[Deminolog]

Что с давлением происходит во время анализа? Если прыгает - у Вас однозначно воздух в системе. В насосе, точнее. Если давление стабильно, но прыжки все равно есть - тоже может быть воздух, только в ячейке дететкора. Например, если это спектрофотометрический (или DAD). Хроматограмму в студию.

[StYV]

Привет коллега!
Одной из причин может быть что изрядно замазан детектор. Вытащить кювету, посмотреть ну и помыть в азотной кислоте или разбавленном хромпике.
И действительно воздух в кювете. На выход капилляр подлиннее - осторожно.
Причин может быть много и давать советы заочно?
С уважением StYV.

[Deminolog]

День добрый!
Ну, хоть пару вещей из траблшутинга можно проверить (безобидных и простых). Сложные варианты, действительно, заочно не проверить...