Определение дитирозина в белках (в плазме, сыворотке крови и др.)

физико-химические методы исследования, методики и другие вопросы аналитической химии
analytical chemistry, analysis and techniques for professionals
Ответить
Demiurg
Сообщения: 129
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Определение дитирозина в белках (в плазме, сыворотке крови и др.)

Сообщение Demiurg » Чт фев 01, 2018 3:05 pm

Здравствуйте!
Ищу информацию по методам определения дитирозиновых (проще говоря дитирозина) сшивок в белках. Образцы биологического происхождения, в первую очередь сыворотка и плазма крови человека и млекопитающих (мыши и крысы). Из имеющихся инструментальных возможностей в наличии только простой ВЭЖХ (Agilent 1100) и микропланшетный ридер-флуориметр (Tecan Infinite M200). То, что нашёл самостоятельно (с точки зрения используемых методик), условно, могу разделить на следующие категории:
1. "простое" измерение флуоресценции (возбуждение в районе 320-330 нм и эмиссия в районе 400-420 нм): образцы (сыворотка, плазма крови) разбавляются в той или иной степени (когда в 50 раз, а когда и в 500) каким-либо буфером и просто измеряется характеристическая флуоресценция дитирозина на каком-нибудь флуориметре.
В литературе приводятся сведения, что флуоресцирует дитирозин только в щелочной среде. Но (сведения из публикаций) измеряют флуоресценцию не только в щелочной среде (обычно в карбонатном буфере), но и при нейтральных значениях pH. Лично я скептически отношусь к методам данной категории (может быть в каких-то модельных постановочных системах типа окисления альбумина такое и прокатывает, но в сильно гетерогенных образцах типа тех же плазмы или сыворотки вряд-ли - будут наверняка засветки со стороны чего-угодно другого и вместе с дитирозином будет флуоресцировать что-нибудь ещё; возможно, что и не сам дитирозин).
2. ELISA (иммуноферментный анализ). Оборудование для его постановки у меня есть, но нет готовых коммерческих наборов (да, их можно купить, но они не дешёвые, да и одного стандартного набора хватит менее чем на 100 определений).
3. условно говоря, разного рода "навороченные" методы определения (масс-спектрометрия, хромато-масс-спектрометрия, эксклюзионная хроматография). Не доступно мне в силу отсутствия необходимого оборудования.
Методов, основанных на простой ВЭЖХ, практически не нашёл (не утверждаю, что искал как следует). Да, чаще всего используется ВЭЖХ, но c какими-нибудь "извращениями":)) из категории 3.

Просьба не расценивать мой пост как что-то типа "поищите-ка за меня". Возможно, кто-то занимался определением и может поделиться информацией. Да, просто высказать своё мнение, видение этого вопроса. Как-то так, в общем.
Спасибо!

StYV
Сообщения: 2409
Зарегистрирован: Пн окт 24, 2005 11:43 pm

Re: Определение дитирозина в белках (в плазме, сыворотке крови и др.)

Сообщение StYV » Вс фев 04, 2018 12:19 pm

Привет коллега!
Вы как-то определитесь:
- определяете свободный дитирозин;
- или эту последовательность в белках.
Методы то разные.
С уважением StYV.

Demiurg
Сообщения: 129
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: Определение дитирозина в белках (в плазме, сыворотке крови и др.)

Сообщение Demiurg » Вс фев 04, 2018 11:23 pm

"Последовательность в белках", как Вы выражаетесь. Дитирозин (В БЕЛКАХ) - это не последовательность, а сшивки между остатками тирозина в полипептидных цепях ( в пределах одной молекулы или же межмолекулярные, но это вторичный вопрос).
Димер из тирозинов не интересует...

StYV
Сообщения: 2409
Зарегистрирован: Пн окт 24, 2005 11:43 pm

Re: Определение дитирозина в белках (в плазме, сыворотке крови и др.)

Сообщение StYV » Пн фев 05, 2018 2:54 am

Привет коллега!
Вам сильно не повезло, проблема многотрудная.
Проще плюнуть и заняться чем то другим, или требовать от руководства полного обеспечения всем необходимым.
На худой конец уйти в другое место, пусть руководство расхлебывает проблему.
С уважением StYV.

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 10257
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Определение дитирозина в белках (в плазме, сыворотке крови и др.)

Сообщение avor » Пн фев 05, 2018 8:39 am

1 если использовать не тупое измерение на одной длине волны,а спектральные данные, для чего нужен более продвинутый прибор, возможно удасться повысить избирательность метода. Но для самого изучения этого вопроса придется использовать методы из 3 и 2, если конечно это не изучил кто-нибудь до вас.
2 Это хороший подход, но не без проблемный, кроме проблем самого ИФА есть еще и проблема того, что часть дитирозиновых сшивок будет недоступна для антител. Ябы попробовал использовать этот подход в формате иммуноблотинга с преварительным денатурирующим электрофорезом, правда все равно понадобяится закупка недешевых антител, да еще и таких, которые работают в иммуноблоте.
3 Этокак бы почти прямой метод и поэтому этакий валидирующий метод,которым можно проверять результаты полученные в первых двух подходах, но понятно дорогой и затратный по времени и оборудованию.

Все вышесказанное сугубо мое ИМХО, подобной работой не занимался.

Demiurg
Сообщения: 129
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: Определение дитирозина в белках (в плазме, сыворотке крови и др.)

Сообщение Demiurg » Вт фев 06, 2018 10:40 am

Я так и "подозревал", что с определением дитирозина не всё так просто:) Нужно достаточно серьёзное инструментальное обеспечение.
Меня, когда я ещё только занялся поиском методик, несколько "смутил" ряд найденных публикаций, где дитирозин определяется просто и незатейливо:
"The content of tryptophan, dityrosine, kynurenine and N0-formylkynurenine was estimated on the basis of their characteristic fluorescence at the wavelengths of 295/340 nm 330/415 nm, 365/480 nm, and 325/434 nm, respectively (Diplock et al., 1991) by measuring the fluorescence of 150 uL serum aliquots in a 96-well plate" (Neurochemistry International Volume 63, Issue 5, November 2013, Pages 507-516. Oxidative modification of serum proteins in multiple sclerosis). Измерялось на Tecan Infinite M200 Pro
"Fifty microliters of plasma diluted 1:60 or dityrosine standard solutions (0–120 pg/ml) in sodium carbonate solution (pH 11.1) were measured by fluorescence spectrophotometry (FluroMax-4; USA) with excitation at 320 nm and emission at 400 nm to detect dityrosine contents." ( Ann Nutr Metab. 2015;66(1):44-50. Elevated plasma dityrosine in patients with hyperlipidemia compared to healthy individuals.).
Вот я и "подумал": "а не сподобится ли и мне на такое же":))

Ответить

Вернуться в «аналитическая химия / analytical chemistry»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 2 гостя