Определить треонин в смеси

[kika]

Здравствуйте, коллеги!
Буду признательна любому совету.
Ситуация такая.
На HPLC треонин (на рисунке) определяется без проблем пока он один в воде. Но идет энзиматическая реакция с превращением -ОН группы в кетоновую. И тут проблема - невступивший в реакцию треонин перекрывается другим пиком, стандарта кето-аминокислоты нет и пока не помогли никакие дериватизации. Поэтому нет возможности оценить конверсию.
Что бы вы посоветовали по определению треонина в смеси?
Заранее огромное спасибо!

[vmu]

Дык, опять же ВЭЖХ, но в других условиях разделения и детектирования... Пробовать надобно. Вариантов много. В модельном двухкомпонентном растворе в воде, возможно, и спектрофотометрии без ВЭЖХ хватило бы, если у кето-продукта спектр достаточно отличается от исходного треонина и при наличии стандарта кето-продукта. Кстати, если у вас нет стандарта, вы не можете быть уверены, что треонин не делится у вас именно с кето-продуктом, а не с чем-то еще из вашей реакционной смеси.

[Nickolas]

Дериватизация и ВЭЖХ. Что значит "не помогли никакие дериватизации"? Не разделяются? Пробуйте другие условия ВЭЖХ, пока не разделятся..

[kika]

Да, надо пробовать дальше.
Спасибо за идею со спектрофотометрией!

[vmu]

Спасибо за идею со спектрофотометрией!

Не за что. Эта идея рабочая только при наличии стандарта кето-продукта и наличии у него в спектре нормального поглощения, скажем, при 240-250 нм (не искал его спектр) и отсутствии поглощения на той же длине волны у треонина (и других компонентов раствора). На более коротких длинах они оба точно поглощают.
Threonine
https://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi? ... V-Vis-Spec
Пробуйте с ВЭЖХ разобраться.

[kika]

Cпасибо огромное, vmu!

[maks]

Если есть проблеммы с вэжх, можно уйти в несколько экзотичный метод для таких задач .Думаю реакцию делают с прицеллом на то, что энзим как-то отделяется от продукта. Взяв по ходу реакции алликват,отделить энзим от водорастворимых, отмерить аналитически точно допустим 5мл , выпарить при высоком вакууме/ миниальной температуре воду. И посмотреть в NMR , на отношение интеграций метилов в самом высоком поле , щепленный в 1.3-1.4 ppm для треонина и синглет примерно в 2.0-2.3 для кетона. Если это только две аминокислоты в смеси , это даст точность в пределах обычной NMR погрешности 4-5 %. Для выяснения кинетики и идет ли энзиматическая реакция вообще, это должно дать ответы

[kika]

Спасибо огромное, maks!
Отличная идея!

[Nickolas]

Эта идея рабочая только при наличии стандарта кето-продукта и наличии у него в спектре нормального поглощения, скажем, при 240-250 нм (не искал его спектр) и отсутствии поглощения на той же длине волны у треонина (и других компонентов раствора). На более коротких длинах они оба точно поглощают.

Проблема будет в ферменте, который активно поглощает свет в этой области.

[maks]

ну судя по отклику топик стартера на предложение мерять в NMR, он отделяется

[kika]

Да, отделяется.
Еще раз, спасибо, maks!