ТСХ экстрактов растений

[Дмитрий Подкопаев]

Здравствуйте, дорогие друзья! Вчера попытался сделать ТСХ экстракта растения на силуфоле в системе гексан-ИПС в трех различных вариантах соотношений (15\85, 50\50, 85\15). В результате основные пятна пигментов вообще не сдвинулись с линии старта. После проявки пластин фосфорномолибденовой кислотой четких пятен не увидел, есть только в системе Гексан-15-ИПС-85 сплошной слегка заметный шлейф. Наносил водный экстракт предварительно нагрев пластину до 60-70 градусов (чтобы пятно высыхало и не расползалось при прикапывании). Может у кого-нибудь есть положительный опыт в методике подбора подвижной фазы для экстрактов растений? Объект изучения - табак и грецкие орехи.

[Гесс]

Я от экстрактов растений далек, но все же:
1) а почему водный экстракт а не раствор в будущем элюэнте
2) всмысле "прикапывнии"? вы не капиляром точки ставите?
3) а гексан-ИПС это обычная система для такого дела? я как то привык к гексан-ЭА

Сорри если для растительных экстрактов это норма.

[surius]

а вы чем экстрагировали, простите? так скажем подбор системы сильно зависит от того что вас там интересует. одно дело если вы его в сокслете на гексане (например) крутили, и другое, если перегонкой с водяным паром "бахнули".
просто в случае с растительным сырьем все очень хитро бывает. что вас интересует в экстракте?

[Дмитрий Подкопаев]

Я от экстрактов растений далек, но все же:
1) а почему водный экстракт а не раствор в будущем элюэнте
2) всмысле "прикапывнии"? вы не капиляром точки ставите?
3) а гексан-ИПС это обычная система для такого дела? я как то привык к гексан-ЭА

Сорри если для растительных экстрактов это норма.

1) Дело в том что водный экстракт обладает биологической активностью. В принципе, можно попробовать этиловый спирт,но точно не известно перейдут ли в него активные компоненты.
2) Точки ставлю автоматической пипеткой с носом на 10 мкл и объемом экстракта 10 мкл.
3) Я где-то видел трехкомпонентную систему гексан-ИПС-ЭА. Просто гексан и ИПС неограниченно растворимы друг в друге и я решил начать с них, попробовав элюенты с разной силой.

[Дмитрий Подкопаев]

а вы чем экстрагировали, простите? так скажем подбор системы сильно зависит от того что вас там интересует. одно дело если вы его в сокслете на гексане (например) крутили, и другое, если перегонкой с водяным паром "бахнули".
просто в случае с растительным сырьем все очень хитро бывает. что вас интересует в экстракте?

На самом деле я просто сделал отвар. Точно известно что он биологически активен.

[avor]

1)Не надо греть пластину перед нанесением. Лучше 10раз нанести по 1мкл и подсушить каждый раз пятно азотом.
2)Забейте вообще на гексан. Попробуйте системы типа спирт:вода, ацетон(или ближайшие кетоны):вода. и используйте две добавки соляную кислоту и аммиак(не одновременно конечно). Попробуйте разные варианты и оно пойдет. Удачи.

[Deminolog]

Это заблуждение, что спиртовые вытяжки не обладают активностью. Еще как. Просто Вы делаете, судя по всему, так, как регламентирует фармакопея. Завариваете и т.д.. Что, в принципе, логично, поскольку употребляться оно будет в таком виде (хотя грецкие орехи вроде как обычно просто едят ). Однако если мы говорим о total содержании, то Вы много чего не извлекаете, часть разрушаете и т.д.. Из пигментов Вы вытягиваете как минимум антоцианы. Кроме того, Вы вытяигваете кучу фенольных соединений, которые являются вторичными метаболитами. Если Вы оцениваете их содержание титриметрически - велкам! Ошибка будет порядка 30%, поскольку пермангонатометрия, которая регламентирована, будет окислять все и вся.
Но вернемся к Вашему вопросу: помимо того, что уже сказано (пластины не греть так, не накапывать, а наносить капилляром - это особенно важно), я абсолютно согласен насчет последней системы.
Далее, если мы говорим о биологически активных веществах, в частности, фенольных, то их также вытягивают этилацетатом. Потом реэкстракция и анализ. Реконструкцию экстракта делают кто как... В любом случае, если Вы собираетесь определять те же фенольные методом ГХ-МС или другими методами газовой хроматографии, не забудьте про дериватизацию, поскольку большинство из них разваливается. Подойдут TMS-производные. Для этого берите BSTFA или MSTFA.
Далее, насчет грецких орехов - если Вы планируете дальше на ВЭЖХ нести экстракты - подумайте об очистке от масел и жиров. Иначе конец колонке придет вколов эдак за 30-50.
А вообще на эту тему очень много литературы есть, поверьте на слово.

[surius]

На самом деле я просто сделал отвар. Точно известно что он биологически активен.

простите мою назойливость, но все же что вас интересует. Ну то есть точно известно что он биологически активен, ОК, вас интересует чем именно, или в каких концентрациях? или вам просто интересно глянуть чего там в отваре есть.
Просто я пытаюсь реализовать для себя что можно вытянуть из ТСХ. Если у вас есть репер, тогда ок, понятно... но, представим (что собственно говоря не так далеко от истины) что у вас в вытяжку ушло много чего, да к тому же там целая куча однотипных соединений - пусть то фенолы или терпенойдные структуры или чего еще там можно придумать, а потом часть из того что вы экстрагировали по тем или иным причинам (температура или на силике) развалилось. В такой ситуации я не поручусь, что вас ТСХ даст хоть сколь-нибудь приемлемое разделение. Я просто хочу сказать, что на мой взгляд ТСХ можно использовать только как быстрый тест, чтобы установить что у вас вообще что-то пошло в отвар и не более того.

[Дмитрий Подкопаев]

2 surius
Меня интересуют действующие вещества.
План исследования таков: разделить мажорные компоненты методом ТСХ, далее соскрести силикагель и провести экстракцию. Таким образом, получатся фракции содержащие меньшее количество веществ. Эти фракции опять поделить на ТСХ с другим элюентом. Опять соскрести силикагель и провести экстракцию. Экстракты подсушить и отправить на ИК-спектроскопию.

[surius]

то есть вы хотите сделать ИК для основных (всех которые удастся выделить в чистом виде) компонентов отвара?
Есть вариант хотя бы пару раз проколоть все хроматографе? Оценить ситуацию так скажем.

[Deminolog]

Сильный план извращений, простите за откровенность... Растительная матрица - совсем не комильфо для такого... Очень, очень много труда на это уйдет... Конечно, есть товарищи, которые препаративно так даже нативные соединения выделяют в приличных количествах, но это очень жестко...

[surius]

Сильный план извращений, простите за откровенность...

Я видел спектр ESI вытяжки форели.Еще то зрелище, скажу я вам. Такого частокола я наверное больше нигде не видел

[Deminolog]

Если Вы про Direct injection - дык тогда можно сделать хорошую подборку частокола Хотя, честно говоря, DI использовать надо аккуратно, как мне кажется... А вообще иногда как посмотришь на то, с чем работают масс-спеки, занимающиеся протеомикой, так и офигеваешь... А если о частоколе... Лежит у меня статейка в которой один товарищ 700 соединений за 10 минут делил Знатный забор Пик на пике и пиком погоняет Но MRM - рулит, как ни крути

[Дмитрий Подкопаев]

то есть вы хотите сделать ИК для основных (всех которые удастся выделить в чистом виде) компонентов отвара?
Есть вариант хотя бы пару раз проколоть все хроматографе? Оценить ситуацию так скажем.

Контроль чистоты фракций, действительно, придется колоть на ВЭЖХ-МС. Изначальный экстракт даже на хорошей длинной колонке С-18 даст неимоверный частокол. Кроме того в экстракте наверняка будут какие-нибудь хитрые сахара и органические кислоты, которые на С-18 не разделятся толком. Там еще и проблема будет в ESI + или - работать.

[StYV]

Мой коллега использовал экстракцию бутанолом и этилацетатом при изучении препарата, получаемого из лигнина и проявляющего противоопухолевую активность. В качестве контроля использовалась ТСХ и обращенно-фазовая ВЭЖХ. Этот подход проще и более производительный.
С уважением StYV.

[Гесс]

Если на ВЭЖХ ожидается частокол то че бы ему на ТСХ разделяться на пятна?
Тады уж можно соскребать по принципу "первый сантиметр", "второй сантиметр", и т.д.

[Дмитрий Подкопаев]

Если на ВЭЖХ ожидается частокол то че бы ему на ТСХ разделяться на пятна?
Тады уж можно соскребать по принципу "первый сантиметр", "второй сантиметр", и т.д.

Чувствую оно так и выйдет

[GreenWorld]

Я как-то пытался делить хроматографией водно-спиртовый экстракт багульника.
Делил без стационарной фазы, т.е. в длинный (около метра) стеклянный жёлоб (разрезанная вдоль трубка от лампы дневного света), установленный под наклоном, прикапывался экстракт в верхнюю часть. По мере стекания и испарения растворителя образовалось с полсотни более-менее индивидуальных зон, из некоторых удалось выделить вполне чистые в-ва.

[Alex_K]

Очень вероятно, что такой подход к выявлению и выделению биологически активного компонента из экстракта "фито-объекта", не приведет к желаемому результату. Биологическая активность растительных экстрактов в большинстве случаев обусловлена суммарным действием комплекса веществ в экстракте, имеющих различную групповую принадлежность. При разделении этого комплекса суммарный эффект пропадает.
Далее, в экстракте содержаться сотни веществ, то есть получается все их нужно проверить на наличие активности...(?) Труд титанический, а результат сомнительный.
И про нагревание, как уже отмечено, - при 60-70 уже идет разрушение фенольных, полифенольных. В водном экстракте, как правило, высокое содержание полисахаридов, которые начинают карамелизоваться.
Но может Вам повезет, и это тот редкий-редкий случай, когда биологическое действие оказывает одно вещество или хотя бы одна конкретная группа веществ.