Помогите определить содержание белка по Бредфорду

вопросы современной биологической химии, молекулярной биологии, химической энзимологии и смежных наук
biochem, molbio, chemical enzymology and related discussions for professionals
Ответить
oceana
Сообщения: 4
Зарегистрирован: Пт сен 30, 2016 10:59 am

Помогите определить содержание белка по Бредфорду

Сообщение oceana » Пт сен 30, 2016 11:01 am

Уважаемые коллеги! Помогите разобраться! Занимаюсь определением активности антиоксидантных ферментов. Их активность пересчитывается на мг белка. Белок определяю по Бредфорду. По какой формуле мне производить расчёт белка???
Заранее спасибо

Joni-Fantazi
Сообщения: 257
Зарегистрирован: Пт май 08, 2009 10:40 am

Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду

Сообщение Joni-Fantazi » Пт сен 30, 2016 1:53 pm

Строим калибровочную кривую по стандарту и получаем требуемую формулу (уравнение типа у = а*х + в; в идеале в=о).

oceana
Сообщения: 4
Зарегистрирован: Пт сен 30, 2016 10:59 am

Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду

Сообщение oceana » Пт сен 30, 2016 2:20 pm

Joni-Fantazi писал(а):Строим калибровочную кривую по стандарту и получаем требуемую формулу (уравнение типа у = а*х + в; в идеале в=о).
Спасибо! Это сделала!Получила концентрацию белка (скажем 2320) по кривой. Перевела её в мг/мл (2,232). Потом посчитала по формуле = 2.232*3 (объем буфера, в котором растирала растения) / 0,3 9масса навески, г). В итоге получила содержание белка: 22,32 мг/г сырой ткани. Правильно ли это7 или нужно ещё умножать на тот объем растит.вытяжки, которую добавляла к Бредфорду?

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 11505
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду

Сообщение avor » Пт сен 30, 2016 2:38 pm

Для того, чтобы ответить на ваш вопрос вы должны подробненько, как на экзамене. рассказать как вы строили градуировку и как вы измеряли белок(имеется ввиду что именно вам надо измерить например: вес белка на грамм ткани(сухой, влажной и тд), на мл буфера или мл экстракта. И подробненько всю процедуру от забора материала до смешивание с реактивом Брэдфорда. А так сумбур один и непонятки.

oceana
Сообщения: 4
Зарегистрирован: Пт сен 30, 2016 10:59 am

Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду

Сообщение oceana » Пт сен 30, 2016 4:05 pm

Avor, расписываю.
Вначале готовила реактив Бредфорда (стандартная методика (Кумасси+этанол+фосфорная ксилота+бидист.вода). Затем его калибровала по БСА (0,1 альбумина растворяла в 10 мл буфера) и затем его разводила: 50мкл БСА+950 буфера, 100 мкл БСА+ 900 буфера, 150 БСА+ 850 буфера и так далее до 450 БСА + 550 буфера. Затем в обычные пробирки добавляла по 5 мл Бредфорда и к ним добавляла по 100 мкл из разведенных пробирок (которые выше рапсисала). Получились пробирки с разной силой окраски: от слобо окрашенного - до сильно окрашенного. Строила калибровочную кривую. В дальнейшем брала 0,3 г навески растений, растирала в 3 мл бфуфера, центрифугировала. Затем брала 100 мкл этой вытяжки и добавляла к ним 5 мл Бредфорда и в дальнейшем на СФ определяла концентрацию белка по калибровочной кривой.
От этого и вопрос, правильно ли расчитываю концентрацию белка = С(цифра, которую выдал СФ по кривой) * 3 / 0,3

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 11505
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду

Сообщение avor » Пт сен 30, 2016 4:22 pm

--0,1 альбумина растворяла в 10 мл буфера
0,1 ЧЕГО? Килограм, грамм, милиграмм, наномоль?
--50мкл БСА+950
950 ЧЕГО литров, миллилитров, микролитров?
У вас СФ сам строил градуировку или вы график сами рисовали и по графику определяли. И что у вас на графике на осях какие величины.
Что вас интересует вес белка в ткани или вес белка в объеме экстракта, тоже не уточнили. Концентрацию своего фермента в единицах вы на ткань пересчитываете или на объем экстракта?


Ну, ведь по человечески просили КАК НА ЭКЗАМЕНЕ! За такой ответ не то что банан вкатать, вынос с экзамена с профнепригодностью можно получить.

oceana
Сообщения: 4
Зарегистрирован: Пт сен 30, 2016 10:59 am

Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду

Сообщение oceana » Пт сен 30, 2016 4:39 pm

0,1 г в 10 мл буфера (ph = 7.8)
50 мкл БСА + 950 мкл буфера (ph=7,8)
СФ строил градуировку сам. Я прописывала концентрации от 500 - 4500, он измерял плотности растворов в кюветах и сам строил градуировку (ось y - плотности, ось X - концентрация, мкг/л)
Концентрацию фермента мне нужно пересчитать на мг белка.

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 11505
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду

Сообщение avor » Пт сен 30, 2016 5:55 pm

По формуле С(цифра, которую выдал СФ по кривой) * 3 / 0,3 вы рассчитаете количество белка в мкг, на г ткани , которое вытягивается из ткани 10х по отношению к весу объемом вашего буфера.

Ответить

Вернуться в «биохимия и молекулярная биология / biochemistry and molecular biology»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 1 гость