аллостерические и без/неконкурентные ингибиторы

[Vanya Ivanov]

Тут у меня возникла мутная темка с синтезом якобы аллостерических ингибиторов протеинкиназы С (изофермент "ХХХ") .. Мене нужно добиться от заказчика четкого обоснования, что ингибитор - аллостерический. Они кинетику не делают, только % снижение фосфорилирования мишеней. Мне кудЫ докинг то делать? В активный центр протеинкиназы или в бочок, который указывают заказчики, а то мы так долго-о-о оптимизацию активности будем делать. Варить компаунды, то мне. .. вот почитал, решил разобраться :
Тридцать лет назад на биохимии как то все это удачно прошло мимо и не отложилось четко.
http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%98%D0% ... 0%BE%D0%B2
Если почитать википедскую страницу, то получается, что вариант и неконкурентного и бесконкурентного ингибирования - это и есть аллостерическое ингибирование, хотя они не называют это аллостерическим ингибированием. Но! При этом в конце авторы пишут, что аллостерическое ингибирование нельзя описать простым уравнением Михаэлиса-Ментона так как это только для олигомерных белков.
Сдается мне, что авторы-википедисты не совсем точны. Так ли это?

[avor]

Эээ, мне кажется, что кинетических данных недостаточно, что бы однозначно утверждать аллостеричность ингибитора. Тут нужны какие то данные по связываню фермента с субстратом(или его не реагирующим аналогом) в присутствии и отсутствии того или другого.

[Vanya Ivanov]

что то не понял этот комент... А какие данные еще можно получить? "Не реагирующий субстрат" - это и есть конкурентный ингибитор?
Кроме кинетических данных можно получить - физ хим (КД - изменение укладки белковой глобулы, ЯМР - изменение в конкретных аминокислотах и что?) ну и конечно РСА, но ни об одном из этих методов в википедской-статье не говориться.... Сколько я помню, фармакологи делают заключение о типе лиганда (агонист/антогонист, алостер или гомостер... исключительно по кинетике фермента или определению эффекта рецептора...

[avor]

-- "Не реагирующий субстрат" - это и есть конкурентный ингибитор?
Ну, типа того.
Я имел ввиду очень простое предположение. Вытесняет ли молекула интереса из комплекса фермент-"конкурентный ингибитор" этот самый конкурентный ингибитор, при чем грубо говоря дозозависимым способом, а не просто изменяя константу связывания конкурентного ингибитора. И делать это лучше не кинетикой, а скажем равновесием на аффинной колонке. Грубо говоря если при очень большом избытке предполагаемой "аллостерической" молекулы фермент все равно остается связанным с "конкурентным ингибитором", то в этом случае можно считать, что исследуемый фактор аллостерический. Ну и если при этом показано , что исследуемый фактор хорошо связывается с ферментом.

[Vanya Ivanov]

не ... что-то я такое первый раз слышу. Лучше всеж мнение специалиста.
Да и для этой изоформы PKC, по мнению биологов, нет еще конкурентного ингибитора в классическом смысле.
Наши биологи-европейчики - упорно называют в-ва аллостерическими ингибиторами, а по структуре - ну вылитые "жители активных центров" , коих известно богато....
И вот ".... меня гложуть смутные сомнения...."

[uchebnik fiziki]

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1 ... x/abstract

В общем, настоящее аллостерическое ингибирование -- ингибирование за счёт связывания в каком-то ином месте, чем активный сайт, но часто этот термин применяют к любому отличающемуся по кинетике от классического конкурентного.

[Vanya Ivanov]

Ну вот это я имел ввиду. Слишком спешили авторы страницы на википедии, т.е. можно разделить все ингибитора на конкурентные и аллостерические. И делается это на основе кинетических графиков. Об этом я и спрашивал...
Ну что же - это очень усложняет мою работу, но глаза боятся, а руки делают.

[ Post made via Android ]

[Vanya Ivanov]

Functional competition between an inhibitor and a substrate should not always be taken at face value. While many biochemists recognize
that competitive inhibition can result from allosteric interference, fewer researchers are aware of the possibility that an active
site–directed inhibitor can yield non-competitive inhibition patterns. The aim of this article is to review the mechanisms that cause
active site–binding inhibitors to display non-competitive behavior. The review focuses on the biochemical mechanism rather than
structural details which, in most cases, are not necessary for the understanding of the phenomenon.
...........Several different mechanisms account for non-competitive inhibition patterns of inhibitors binding in the active site.

Спасибо за статейку, грамотная и понятная! В принципе, все сложней оказалось.
Изо- или аллостерический ингибитор - это скорей теоретические термины, а конкурентный - не конкурентный - это практические термины, основанные на изучении кинетики ингибирования.
Авторы обзора вводят термин - экзосайт. Это сайт рядом с активным центром и структурно и функционально зависящим от него.

В итоге: пока нет RSA твоего ингибитора с белком, корректный докинг не получишь... Так то. Ну в принципе я уже перебрался с докинга на 3D QSAR. буду ждать результатов.

[avor]

В итоге: пока нет RSA твоего ингибитора с белком, корректный докинг не получишь...

А зачем тогда докинг, если есть RSA c лигандом

[uchebnik fiziki]

Скажем так: при отсутствии РСА с конкретным лигандом делать оптимизацию на основе докинга можно только в том случае, если есть железобетонная уверенность в правильности предлагаемого способа связывания. РСА её обычно даёт, после чего применение докинга становится рутинным.

[Vanya Ivanov]

Как обеспечить "железобетонную уверенность" при применении докинга? Значение R² и Q² для уравнения модели корреляции между константами связывания расчетной (докинг) и связывания экспериментальная - явно не катит.
Какой метод предикшина будет корректным если нет RSA?
На язык просится ответ: - " не докинг ..."

[uchebnik fiziki]

Да нет, и на основе докинга можно работать, но осторожно. Как минимум, нужна уверенность во взаимодействии вещества с конкретным сайтом или его областью. Ну и докинг делать не в режиме чёрного ящика, а вдумчиво и аккуратно, работая с молдинамикой либо Монте-Карлой и химической интуицией, применяя фармакофорные методы.

А прогнозировать -- ну смотря что вы хотите прогнозировать.

[Vanya Ivanov]

Мне кажется, что слова "вдумчиво и осторожно" относится вообще к планированию работы, а не к конкретной задаче.
В моем конкретном случае хотя и есть некоторые спекуляции по поводу одного из аллостерисческих центров PKC-XXX, докинг будет не корректен. А поскольку уже сварено и тестировано с полсотни компаундов, все таки корректней будет применять 3D QSAR или фармакофорную модель. Хотя мне лично удобней делать 3d qsar, меньше ограничений на "химические фантазии", которые можно воплотить в реалии.

[uchebnik fiziki]

У меня просто к чистому 3D-QSAR весьма настороженное отношение, без учёта молекулярной формы им довольно неудобно пользоваться.

[pH<7]

Есть такой Yonetani-Theorell plot

Варил я как-то аллостерические ингибиторы ВИЧ-протеазы, варил, варил и ничего хорошего не сварил. Было ингибирование, были кристаллические структуры, но с ними всегда риск что связывание вызвано тем и только тем что соседняя молекула белка в кристалле создаёт новый сайт для связывания. Самое неприятное было что неизвестно было могут ли наши молекулы вместо хренового аллостерического пойти в замечательный активный центр, где огромная гидрофобная дырка. Перестал я этим заниматься когда получил кристаллическую структуру с четырьмя (!) молекулами предполагаемого аллостерического ингибитора в активном центре.

Так что дальше без меня варят: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cb300611p

[Vanya Ivanov]

Статья, да и все оформление супер. Но что-то мне подсказывает что компаунды для скрининга отбирали биологи, а не мед химики. Вот у меня ситуация повторяется (правда без такой шикарной публикации, только скромный патентишко, да и тот еще где-то плавает в недрах EPO)
Именно в таком виде и работают наши европейские коллеги. Они измеряют активность синтетических компаундов по торможению межбелкового взаимодействия нашей PKC с рецепторными белками, которое , как и они полагают и общепринято, идет через аллостерический центр.
Но, существует большое НО, нам таки почти удалось убедить наших коллег-биологов, что компаунды должны быть сложней, гораздо сложней.
Тут можно обсуждать такую тонкость мед химии: существует ли один или несколько оптимумов ligand efficiency (LE) в вашей модели (результатах).
Жалко что в статье вы не указываете SAR - на рисунке 7 страница G, почему-то только R1,R2 ect , а саппорт матириалс я не нашел. Так вот, возможно стоило было бы поиграть с усложнением структуры и поискать второй оптимум LE. И это предотвратило бы связывание лиганда с активным центром или двумя центрами сразу.
И все дифирамбы которые пели биологи (а я полагаю, что именно они писали статью) в интродакшене преимуществам аллостерического ингибирования подтвердились.
Для меня эта интересная статья - скорее исключение из правил, чем правило.