Здравствуйте!
Обращаюсь к уважаемой общественности форума с таким вот вопросом:
Есть методика (из статьи) по определению связанных (в основания Шиффа) с белками некоторых продуктов перекисного окисления липидов, а именно - МДА и 4-HNE. Одним из этапов этой методики является гидролиз этих самых Шиффов в сильнокислой среде, для чего предварительно рН анализируемых образцов нужно довести до 1,5 соляной кислотой. Вопрос собственно в следующем: какой объем соляной кислоты (и какой концентрации) нужно добавлять к 200 мкЛ образцов (сыворотка, плазма крови, тканевые гомогенаты) для гарантированного доведения их рН до нужного? Дело в том, что микрорН-метра в наличии нет, а анализируемые образцы - это микрообъемы (не более 200-300 мкЛ), от мелких грызунов (мыши и крысы) затруднительно получить несколько десятков мЛ плазмы или сыворотки. Как бы это сколько-нибудь добавлять к образцам соляной к-ты, чтобы наверняка получать нужное значение рН? В дальнейшем к образцам добавляется 150 мкЛ 37%-й соляной кислоты, так может этот объем можно добавлять к образцам до гидролиза Шиффовых оснований?
Если лень смотреть статью, то вот методика:
Hydrolysis of Schiff Bases from MDA and Proteins.
Tissues or cells were homogenized at 4 °C in 20 mM Tris buffer
(pH 7.4). The homogenates were centrifuged for 10 min at
2000g and 4 °C. The supernatants were adjusted to pH 1.5 with
diluted HCl, and then 200 mcL aliquots were hydrolyzed for 80
min at 60 °C. Diluted 1-methyl-2-phenylindole (650 mcL) in
acetonitrile/methanol (3:1) or acetonitrile/methanol alone (sample
blanks) was directly added to the hydrolyzed samples. The
reaction was started by the addition of 150 mcL of 37% hydrochloric
acid or methanesulfonic acid. The 586 nm absorbance
of the reaction mixture was read upon incubation at 45 °C and
subsequent centrifugation at 9000g for 10 min.
Plasma samples were adjusted to pH 1.5 with diluted
hydrochloric acid, and then 200 mcL aliquots were hydrolyzed
for 80 min at 60 °C and subsequently used for the assays, as
described above.
Alternatively, tissue homogenization or cell lysis can be
directly performed in diluted hydrochloric acid, at pH 1.5. The
resulting sample was hydrolyzed for 80 min at 60 °C, and then
centrifuged (low-speed, 10 min, 4 °C). The assay was performed
as described above, using procedure 1 or 2, on 200 mcL aliquots
of the supernatant.
1H NMR studies have shown that 4-hydroxyalkenals undergo
a fast and irreversible cyclization reaction to 2-pentylfuran in
the presence of hydrochloric acid, if the chromogenic reagent is
absent (46). Hence, upon hydrolysis in diluted hydrochloric acid,
4-hydroxyalkenals were converted into furan compounds that
were unable to react with 1-methyl-2-phenylindole. Therefore,
the hydrochloric acid-based assay (procedure 1) as well as the
methanesulfonic acid-based assay (procedure 2) allows the
specific measurement of the amount of total MDA upon prior
hydrolysis of Schiff bases in hydrochloric acid.
Спасибо!
доведение рН биол. образцов до 1,5
доведение рН биол. образцов до 1,5
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.
-
- Сообщения: 193
- Зарегистрирован: Вс авг 07, 2011 8:35 pm
Re: доведение рН биол. образцов до 1,5
Так супернатант будет представлен трисом+еще органика из клеток. Фактически нужно будет закислить трис сделав поправку на возможные буферные свойства органики. По трису еще можно как-то рассчитать (ну или попробовать на большем объеме), а вот учесть эффект органики вряд ли получится. Может имеет смысл не добиваться строго 1.5, а просто закислить с избытком? Гидролиз все равно пройдет и при 1,2 и при 1.3.
Re: доведение рН биол. образцов до 1,5
Вот-вот, и я про то, что:
1) добиваться рН именно 1,5 возможно не надо, а достаточно, чтобы было не выше 1,5
2) если к 200 мкЛ образца добавить сразу 150 мкЛ 37%-й HCl - pH явно уйдет к 0, не то, что к 1,5 (но можно ли так делать - не знаю, может в таком случае методика не пойдет)
А если это не гомогенат (на основе триса или с его наличием), а сыворотка или плазма, которые обладают буферностью только сами по себе (за счет белков)?
В общем вопросы: 1) объем (и концентрацию) HCl, необходимый для гарантированного снижения рН до 1,5 2) нужно ли именно рН 1,5 3) можно ли добавлять 150 мкЛ 37%-й HCl перед гидролизом ОСТАЮТСЯ В СИЛЕ.
1) добиваться рН именно 1,5 возможно не надо, а достаточно, чтобы было не выше 1,5
2) если к 200 мкЛ образца добавить сразу 150 мкЛ 37%-й HCl - pH явно уйдет к 0, не то, что к 1,5 (но можно ли так делать - не знаю, может в таком случае методика не пойдет)
А если это не гомогенат (на основе триса или с его наличием), а сыворотка или плазма, которые обладают буферностью только сами по себе (за счет белков)?
В общем вопросы: 1) объем (и концентрацию) HCl, необходимый для гарантированного снижения рН до 1,5 2) нужно ли именно рН 1,5 3) можно ли добавлять 150 мкЛ 37%-й HCl перед гидролизом ОСТАЮТСЯ В СИЛЕ.
-
- Сообщения: 193
- Зарегистрирован: Вс авг 07, 2011 8:35 pm
Re: доведение рН биол. образцов до 1,5
Данный вопрос очень частный, ответить на него смогут, наверное, только авторы статьи или тот, кто воспроизводил методику. Видимо проще провести оптимизацию добавляя разное количество солянки. Сам также танцевал с FMOC когда работал с плазмой и ВЭЖХ.Demiurg писал(а):Вот-вот, и я про то, что:
1) добиваться рН именно 1,5 возможно не надо, а достаточно, чтобы было не выше 1,5
2) если к 200 мкЛ образца добавить сразу 150 мкЛ 37%-й HCl - pH явно уйдет к 0, не то, что к 1,5 (но можно ли так делать - не знаю, может в таком случае методика не пойдет)
А если это не гомогенат (на основе триса или с его наличием), а сыворотка или плазма, которые обладают буферностью только сами по себе (за счет белков)?
В общем вопросы: 1) объем (и концентрацию) HCl, необходимый для гарантированного снижения рН до 1,5 2) нужно ли именно рН 1,5 3) можно ли добавлять 150 мкЛ 37%-й HCl перед гидролизом ОСТАЮТСЯ В СИЛЕ.
ЗЫ: вообще достаточно странно, что авторы не указали количество солянки. Вроде и журнал достойный и авторы из Франции.
Re: доведение рН биол. образцов до 1,5
Здравствуйте
Как легко прикинуть, вам надо получить ПРИМЕРНО 0,5 М раствор солянки. Трис и прочее, как легко догадаться, при такой концентрации кислоты погоды не сделают.
Можно, кстати, прикинуть с молоком в качестве модельной жидкости. Именно с молоком из ближайшего магазина
Добавляйте к нему солянку, меряйте рН и то соотношение, которое даст нужное значение и будет достаточно близким к желаемому. Естественно, таким способом рН установить точнее +-0,1-0,2 не получится.
Как легко прикинуть, вам надо получить ПРИМЕРНО 0,5 М раствор солянки. Трис и прочее, как легко догадаться, при такой концентрации кислоты погоды не сделают.
Можно, кстати, прикинуть с молоком в качестве модельной жидкости. Именно с молоком из ближайшего магазина

Re: доведение рН биол. образцов до 1,5
Спасибо за практические рекомендации - надо будет, конечно, попробовать!
А вот как насчет такого варианта для определения только связанных с белками (в виде шиффовых оснований) MDA/4-HNE: сначала осадить белок из анализируемых проб (той же сыворотки или плазмы) ацетоном или ТХУ, отделить центрифугированием и суспендировать осадок белков в 0,04 М HCl (солянка такой концентрации имеет рН 1,5), далее делать по методике (инкубация 80 мин. при 60 гр)? Возможно, следует суспендировать осадок не в 0,04 М HCl, а в каком-нибудь буфере с рН 1,5, но столь "кислый" буфер еще надо постараться найти. Вот эта прога (http://www.chembuddy.com/?left=Buffer-M ... calculator) из всех забитых в её базу буферов смогла найти только один, который при 60 гр. имеет рН 1,5 - пирофосфатный (пирофосфат Na/ортофосфорная кислота).
И ещё хотелось бы уточнить: а почему (легко прикидывая) нужно получать именно ПРИМЕРНО 0,5 М раствор солянки?
Спасибо!
А вот как насчет такого варианта для определения только связанных с белками (в виде шиффовых оснований) MDA/4-HNE: сначала осадить белок из анализируемых проб (той же сыворотки или плазмы) ацетоном или ТХУ, отделить центрифугированием и суспендировать осадок белков в 0,04 М HCl (солянка такой концентрации имеет рН 1,5), далее делать по методике (инкубация 80 мин. при 60 гр)? Возможно, следует суспендировать осадок не в 0,04 М HCl, а в каком-нибудь буфере с рН 1,5, но столь "кислый" буфер еще надо постараться найти. Вот эта прога (http://www.chembuddy.com/?left=Buffer-M ... calculator) из всех забитых в её базу буферов смогла найти только один, который при 60 гр. имеет рН 1,5 - пирофосфатный (пирофосфат Na/ортофосфорная кислота).
И ещё хотелось бы уточнить: а почему (легко прикидывая) нужно получать именно ПРИМЕРНО 0,5 М раствор солянки?
Спасибо!
Кто сейчас на конференции
Сейчас этот форум просматривают: Bing [Bot] и 4 гостя