проблема с дериватизацией аминокислот ОФА

вопросы современной биологической химии, молекулярной биологии, химической энзимологии и смежных наук
biochem, molbio, chemical enzymology and related discussions for professionals
Ответить
ruderal
Сообщения: 91
Зарегистрирован: Пн авг 22, 2011 5:03 pm

проблема с дериватизацией аминокислот ОФА

Сообщение ruderal » Ср июл 01, 2015 4:44 pm

В нашей работе стоит задача дериватизации аминокислот и олигопептидов орто-фталевым альдегидом (ОФА) для образования флуоресцирующих аддуктов с их последующим определением на ВЭЖХ.
Однако реакция дериватизации проходит не всегда. От чего зависит активность дериватизирующего агента мы разобраться не можем. Схема приготовления ОФА-реактива:
6,3 мг OPA растворяется в 100 мкл метанола,
добавляем 1,9 мл 40 мМ боратного буфера pH 9,4.
перемешиваем и добавляем 7 мкл меркаптоэтанола. Тщательно перемешиваем.
Конечные концентрации: OPA - 23 мМ, меркаптоэтанол - 50 мМ.
Полученный раствор ставим в холодильник на 2-3 часа.
Полученный раствор используется в течение двух дней, затем готовится новый OФА-реагент.
Приготовление калибровочных растворов проводится путем смешения ОФА и водного раствора аминокислоты 1:1. Дериватизацию проводим в течение 2-3 минут.
Почему не происходит дериватизации орто-фталевым альдегидом и в чем может быть наша ошибка при приготовлении дериватизирующего агента?

Будем крайне признательны за любые советы и помощь.

Аватара пользователя
Vanya Ivanov
Сообщения: 1741
Зарегистрирован: Пн авг 29, 2005 6:40 pm

Re: проблема с дериватизацией аминокислот ОФА

Сообщение Vanya Ivanov » Ср июл 01, 2015 11:48 pm

Во первых: меркаптоэтанол добавляют только в раствор цистеина перед добавлением ОФА, т.к. он реагирует с ОФА. Боратный буфер нужен только для создания щелочного рН, если у вас соли аминокислот по аминогруппе, то и нафиг он нужен просто прикапайте NaOH до щелочного рН, чтобы аминогруппа была свободной от солей и не в цвитерионной форме, а чтобы не портить колонку щелочью реакционную смесь разводите перед анализом вэжхашным буфером и ацетонитрилом.
Мы чтобы уберечь колонку от реакционной смеси - фильтровали ее через "носик" с силикагелем. Колонка С-18 жила до 3.5 - 5 тыс анализов.

Методика: В водно-спиртовой (1:2) р-р аминокислот прикапывют 0.1 н р-р NaOH до рН = 10.0, перемешивают на холоду 4-10 оС 15-30 сек. и добавляют 1.5 экв изыток р-ра ОФА в метаноле. Перемешивают при к.т. 5 мин. Прибавляют одинаковый объем раствора рабочий буфер - ацетонитрил (1:2), перемешивают. Смесь пропускают через пластиковый наконечник 1 мл автоматической пипетки, с уплотненным кусочком ваты, 0.1 мл силикагеля, и 0.1 мл безводного сульфата натрия и собирают в мерной колбе. Слой промывают еще двумя объемами раствора буфера-ацетонитрила в ту же колбу. Доводят до метки и вэжхируют.
У меня в стандартной системе (градиент тфу - ацетонитрил - был только не для хроматографии) на кромасил-С-18 5 мкм - 10 см при 254 нм (другого сфетофильтра не было) - 50 - 75 пмоль аминок-т сияли и колибровались великолепно. А не пропрореагировавший ОФА выскакивал с фронтом.

Вот еще методика ... первое, что попалось на глаза в инете
ОФА-метод.jpg
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

ruderal
Сообщения: 91
Зарегистрирован: Пн авг 22, 2011 5:03 pm

Re: проблема с дериватизацией аминокислот ОФА

Сообщение ruderal » Чт июл 02, 2015 11:11 am

Огромное спасибо!
Буду пробовать.

Аватара пользователя
dan14444
Сообщения: 2541
Зарегистрирован: Ср окт 10, 2007 2:14 am

Re: проблема с дериватизацией аминокислот ОФА

Сообщение dan14444 » Пн авг 03, 2015 3:06 pm

Очень желательно добавлять детергент. Несмотря на ВЖХу. Без него с воспроизводимостью плохо.
Ну а меркаптоэтанол добавлять последним - но не "отдельно в АК" - краска с ним вполне стабильна, он реагирует с ОРА только в присутствии амина (для того и нужен).

Причём тут цистеин - не понял, меркаптан нужен всегда!

Основная проблема - аддукт нестабилен (в воде совсем, в ацетонитриле - получше, но тоже плохо, за полдня валится на 10%).

Аватара пользователя
Vanya Ivanov
Сообщения: 1741
Зарегистрирован: Пн авг 29, 2005 6:40 pm

Re: проблема с дериватизацией аминокислот ОФА

Сообщение Vanya Ivanov » Чт авг 13, 2015 1:12 pm

dan14444 писал(а):Очень желательно добавлять детергент. ...Причём тут цистеин - не понял, меркаптан нужен всегда!
Зачем детергентом убивать колонку? :issue: Просвятите ....

Меркапто-соединения действительно нужны, для увеличения стабильности флюоресцирующих продуктов.
Fluorescence detection of Amino Acids.pdf
Однако я, работал с аминокислотами и биогенными аминами, только для "обкатки методики" без меркапто, для образования изоиндолов для УФ детекции (без флуоро-детектора). А саму методу разработал для аминогликозидных антибиотиков .... вполне нормально работало .... на лек формах.
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

Аватара пользователя
dan14444
Сообщения: 2541
Зарегистрирован: Ср окт 10, 2007 2:14 am

Re: проблема с дериватизацией аминокислот ОФА

Сообщение dan14444 » Чт авг 13, 2015 3:49 pm

Без меркаптана не пробовал, удивлён, что реакция вообще идёт... Может, там тупо шифф образуется? Какой спектр получался?

Насчёт ПАВ - я до сих пор не понимаю, зачем они нужны - но без них с воспроизводимостью бяда. Возможно, аминогликозиды после модификации или сорбируются или выпадают... А может, квантовый выход они как-то стабилизируют... Не знаю.

А можно на Вашу методику взглянуть? И что было со стабильностью аддукта?

Аватара пользователя
Vanya Ivanov
Сообщения: 1741
Зарегистрирован: Пн авг 29, 2005 6:40 pm

Re: проблема с дериватизацией аминокислот ОФА

Сообщение Vanya Ivanov » Чт авг 13, 2015 7:08 pm

методика выше (пост от 01-06-2015). В смеси ацетонитрила, метанола и воды - аддукты не выпадали. Мерную колбу разводил -подвижной фазой - (собирал после колонки, после стабилизации базовой линии - 1:1 тфу (0.01%) - АН). Картинки боюсь не найду - лет 15-20 назад делал в среде windows2.0 (gilson) (нужно старые харды к старым компам подключать... :( , бумажные копии где-то по папкам, может подниму ....
На самом деле - я отказался от этого метода в конце .... ОФА - был дорог (для задрипанного сов нии). Тупо делал метод с хаг 2,4-динитро-бензойной к-ты. Дешевле ставить на поток было.

Аватара пользователя
dan14444
Сообщения: 2541
Зарегистрирован: Ср окт 10, 2007 2:14 am

Re: проблема с дериватизацией аминокислот ОФА

Сообщение dan14444 » Пт авг 14, 2015 4:19 pm

Если Вы делали таки без меркаптана - у Вас, вероятно, получались шиффы, которые и не выпадали... И которые тоже поглощают... Но как на этом удалось сделать воспроизводимую метдику - для мну великая тайна... :)

Аватара пользователя
Vanya Ivanov
Сообщения: 1741
Зарегистрирован: Пн авг 29, 2005 6:40 pm

Re: проблема с дериватизацией аминокислот ОФА

Сообщение Vanya Ivanov » Пн авг 17, 2015 12:07 am

dan14444 писал(а):... вероятно, получались шиффы, которые и не выпадали... И которые тоже поглощают... ...
изоиндолы...

Ответить

Вернуться в «биохимия и молекулярная биология / biochemistry and molecular biology»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 1 гость