Тестирование биологической активности, протеинкиназы

[avor]

Кстати, еще один, наверное, самый прямой способ тестирования ингибиторов - HPLC. Немного трудоемкий, зато ничего практически для этого не нужно. Лишь субстрат, киназа, АТФ ну и из оборудования - ВЭЖХ.

Чувствительность стандартных (не MS) детекторов ВЭЖХ на пару тройку порядков ниже иммуноферментных методов детекции. А иммуноферментные методы детекции еще на пару порядков менее чувствительны чем методы с радиоактивной меткой. Вам понадобятся гораздо больше киназы и субстрата просто ведра (по сравнению с микропробирками для других методов). Что касается MS-детекции, то там очень много вопросов к метрологии съемки кинетики.

[Vanya Ivanov]

..... Тогда любая киназа будет фосфорилировать любой попавшейся под руку серин, треонин, тирозиновый аминокислотный остаток. О какой специфичности передачи сигнала и специфичности ответа на сигнал можно тогда говорить?...

Ой-ой-ой .... азы биохимии освоили лет 30 назад .... Вопрос не про учебник, а по существу - не формально. Определения киназ в био-каше мало интересно, так-как всегда оканчивается одним и тем же умным научным конклюжином .... "а фиг его знает почему!"
Я про тест-системы имел ввиду. Почему к каждой киназе компашка свой пептид (нифига не дешевый) варит? Денег поднять или правда ... кроме мотива-фосфорилирования нужны специфические кластеры связывания? У кого правда Брат?

[Nickolas]

Чувствительность стандартных (не MS) детекторов ВЭЖХ на пару тройку порядков ниже иммуноферментных методов детекции. А иммуноферментные методы детекции еще на пару порядков менее чувствительны чем методы с радиоактивной меткой. Вам понадобятся гораздо больше киназы и субстрата просто ведра (по сравнению с микропробирками для других методов). Что касается MS-детекции, то там очень много вопросов к метрологии съемки кинетики.

Все верно. Но HPLC (или лучше UPLC) может оказаться намного дешевле и доступнее, чем другие методы. Все зависит от того, сколько имеется потенциальных ингибиторов и на скольки киназах их хотят потестить. Если ингибиторов сотни, а киназ десятки, то да, HPLC не потянет А если там десяток веществ и пару киназ, то вполне осязаемо. "Ведра" субстрата тут будут миллиграммовые.

[avor]

Определения киназ в био-каше мало интересно, так-как всегда оканчивается одним и тем же умным научным конклюжином .... "а фиг его знает почему!"

Смотря чего вы добиваетесь. Если вы проводите первичный скрининг ингибиторов, то очень даже полезен. Ибо вы в одной точке сразу определяете ингибирующую способность к туче киназ. А выбрав позитивные структуры, вы отсеиваете драги, которые сразу ничего не показывают. Потом вы уже начинаете специфичный отсев по определенным киназам из того позитивного, что осталось.
Если же вы сразу занимаетесь ингибированием определенной киназы, то совершенно разумно с ней и работать и не заморачиваться с бульоном из клеточного лизата.

Я про тест-системы имел ввиду. Почему к каждой киназе компашка свой пептид (нифига не дешевый) варит? Денег поднять или правда ... кроме мотива-фосфорилирования нужны специфические кластеры связывания? У кого правда Брат?

Я тут прикрепил файл, что удалось скачать. Более свежий обзор закажите в соответствующем разделе форума.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21712544

[Vanya Ivanov]

классные обзорчики, искренне спасибо.

Вот обзор - сравнения методов тестирования для скрининга - грамотно сравнивают и я последние годы на эту инфу ориентируюсь:

Expert Opin. Drug Discov. (2008) 3(6) 607-621-kinase_review.pdf