Тестирование биологической активности, протеинкиназы

[farynaa]

Хотим тестировать полученные соединения в отношении протеинкиназ (тирозин и серин/треонин). Собственными силами.

Не могу понять, как это вообще делается. Где и какие ферменты нужно покупать, какое оборудование необходимо, какие процедуры используются. Может у кого есть опыт такой работы? Расскажите хотя бы в общих чертах.

[avor]

Есть два подхода.
Первый очень простой(на первый взгляд) и скажем так интегральный. Вы берете культуру клеток. Делаете из нее лизат. В лизат добавляете Меченную З2(или 33, что красивее, но дороже) фосфором АТФ по гамма положению. И инкубируете в течении, допустим часа, при 37°С затем берете этот лизат и капаете на фильтр подсушиваете и полощите фильтр в 15% ТХУК(трихлоруксусная к-та) в нескольких сменах минут по 15. Высушиваете.И все! Дальше кладете фильтр в виалу со сцинцилятором и на счетчик. ТХУК осаждает белки и НК на фильтре, все остальное отмывается. Таким образом вы измеряете включение фосфора из АТФ в белок(потому что НК во-первых кинируются не особо, во-вторых их в обычном цитоплазматическом лизате практически нет).Соответственно вы можете смотреть включение фосфора в белки: без своих веществ(норма), со своими веществами в разных концентрациях и с веществами ингибирующая способность, которых хорошо известна.
Есть как минимум три проблемы в этом случае. 1) В России не производятся радиоактивные изотопы фосфора(соответствующая кислота для синтеза соответствующей АТФ). 2)В России органы РБ по закрывали большинство лицензированных изотопных лаб.(блоков). 3) для работы с культурами клеток нужно соответствующим образом оборудованная лаборатория и персонал: Ламинарные Боксы, СО2-инкубаторы, криохранилище, расходка.

Второй таргетный или целевой, узко специализированный. Например вас интересует ингибирование конкретной киназы фосфорилирующий конкретный белок-мишень(он-же субстрат киназы). В этом случае вам понадобится. Все тот же клеточный лизат с киназой. Антитела к субстрату-мишени и антитела к фосфорилированному сайту белка субстрата мишени. Вы берете клеточный лизат добавляете в него АТФ и инкубируете. Затем в совершаете действие под названием иммунопреципитация на белок-мешень субстрат. В результате этого действия вы с помощью антител к белку мишени-субстрату выделяете этот белок на твердой фазе, которую легко отделить от раствора. Далее с этой твердой фазы в результате пробо-подготовки вы получаете белковую пробу для SDS диск - электрофореза в полиакриламидном геле, проводите сей процедур с пробой, после чего наступает следующая фаза иммуноблот, в результате которого вы делаете реплику с ПААГ на твердую мембрану, а затем с помощью антител к сайту фосфорилирования белка субстрата мешени выявляете фосфорилированную форму мишени на мембране. Эта с виду понятная процедура имеет много проблем.

1) наличествующий в лизате субстрат-мишень может изначально быть в сильно фосфорилированной форме или его там будет очень мало, тогда на фоне константно фосфорилированной формы можно просто не заметить прироста или просто ничего не заметить из-за слабости сигнала. 2) проблема связана с киназой может оказаться, что ее мало в лизате или она потеряла активность сама по себе без всяких ингибиторов и соответственно вы не увидите никакого фосфорилирования. В идеале эти проблемы решаются использованием чистых нативных белков: белка-субстрата-мишени и киназы. В этом случае даже и электрофорез не понадобился бы с иммунопреципитацией, а просто можно было бы реакционную смесь сразу наносить на мембрану и выявлять в нем фосфорилированную форму субстрата антителами(дот-блот). Но в большинстве случаев они(чистые киназа и ее белок-мишень) не доступны. Тогда проблему решают использованием лизатов штаммов ГМО, которые продуцируют нативные дефосфорилированные формы белка -субстрата-мишени и другой штам, продуцирующий активную киназу в большом количестве. Иногда эти штаммы приходится готовит так сказать ex tempore трансформацией немодифицированных организмов заранее созданной генетической конструкцией(потому что генная модификация не всегда носит устойчивый характер) В зависимости от организма, на котором ставится эксперимент и доступа к штаммам иногда используют только один штамм, а вместо другого подбирают объект, про который хорошо известно, что там (например много дефосфорилированного белка-мишени).

Трудности в данном случае это кроме оборудования для культур клеток, понадобится оборудование для электрофореза и иммуноблота. А так же оборудование для генетичеческих манипуляций, ну и соответственно наличие персонала способного на нем работать. К расходке добавятся антитела, штаммы и всякая хрень для фореза и генной инженерии, генетические конструкции и тд.тп.

Еще есть третий вариант. когда вы работает на уровне организма. Т.е. свой драг вы добавляете не в раствор, в котором плавает киназа, а организму, например в кровь или перорально или в среду для культивирования клеток. Но в этом случае вам вряд ли подойдет обычный нормальный организм. Вам скорее всего понадобится какой-то модельный организм, на котором хорошо показано что процессы активности(неактивности) определенной киназы приводят к каким-то легко определяемым феноменам, которые и предстоит вам анализировать. Замечу однако, что в этом случае практически не возможно будет доказать прямое ингибирование киназы веществом, не поставив соответствующих экспериментов, описанных выше. Тк в организме ингибирование может быть опосредованным, например действием вещества на какие-то другие рецепторы и ферменты в результате чего происходит опосредованное ингибирование работы киназы.

[farynaa]

Спасибо за развернутый ответ, но в таком варианте мы не потянем. Мы же химики, а не микробиологи)

[uchebnik fiziki]

ну можно купить робота, чтоб он на ферменте делал с флуоресцентным детектированием и его минусами

[farynaa]

ну можно купить робота, чтоб он на ферменте делал с флуоресцентным детектированием и его минусами

и сколько он стоит?

http://www.sigmaaldrich.com/content/dam ... 173bul.pdf
вот тут про какой-то набор киназ идет речь и там методика. как я понял, в лунки заряжаем свой раствор с веществом, капаем буфера, потом киназу с атф, а потом на спектрофотометре смотрим интенсивность на 590нм. Это то, что мне нужно?

[uchebnik fiziki]

это не набор киназ, а набор реагентов, киназы надо покупать отдельно
капать можно и руками

[Vanya Ivanov]

При всем искреннем уважении к коллегам по форуму - все ответы полный шлак.
Так с киназами не работают естественно. Коллеги, давшие ответ, имеют очень хороший опыт, но почему то мутят воду? Не понимаю почему.
Может личные счеты? Не вижу доброжелательности от таких ответов.

Обратитесь к биологам www.molbiol.ru
Может там люди более доброжелательные найдутся?

Сам не делаю работу с киназами, а получаю результаты био скрининга от коллег:
Работают только с чистыми рекомбинантными белками (киназы мыши или человека) - это точней, быстрей и дешевле.
(найдите удобного поставщика, т.к. у всех различные ферменты) Покупаете на фирме вашу киназу, набор: субстрат для фосфорилирования (различные олиго пептиды), меченный 31P-АТФ, буфер (с нужными ионами), методику ну и сцинциляционный счетчик.
За такую покупку вас всех западные фирмачи оближут.
В химраре (Химки) делают анализ на ингибирование киназ при одиночной концентрации и/или IC50, но на очень невыгодных условиях.
А еще проще обратитесь к западной фирме - дешевле и быстрей, а главное точнее - если секретность не лимитирует.

[uchebnik fiziki]

Работа с радиоактивностью требует специальных разрешений и оформления, если люди ранее этого не делали -- могут быть проблемы/геморрой. Проще посылать в конторы типа Reaction Biology (или что-то вроде того).

[avor]

Коллеги, давшие ответ, имеют очень хороший опыт, но почему то мутят воду?
Работают только с чистыми рекомбинантными белками (киназы мыши или человека) - это точней, быстрей и дешевле.
(найдите удобного поставщика, т.к. у всех различные ферменты) Покупаете на фирме вашу киназу, набор: субстрат для фосфорилирования (различные олиго пептиды), меченный 31P-АТФ, буфер (с нужными ионами), методику ну и сцинциляционный счетчик.

Ничего они не мутят, это один из вариантов, озвученный выше, при чем в более дешевой форме дот-блота или ELISA: " В идеале эти проблемы решаются использованием чистых нативных белков: белка-субстрата-мишени и киназы. В этом случае даже и электрофорез не понадобился бы с иммунопреципитацией, а просто можно было бы реакционную смесь сразу наносить на мембрану и выявлять в нем фосфорилированную форму субстрата антителами(дот-блот)". И тут же даны ограничения этого метода: "Но в большинстве случаев они(чистые киназа и ее белок-мишень) не доступны." Так же к ограничением этого метода является, то что вы заранее ограничиваете себя одной или несколькими парами фермент-субстрат. В результате вы можете констатировать ингибирование только одной киназы, что будет с другой вы не знаете. Или наоборот, вполне возможно вы не обнаружите эффекта на данной паре, а на другой паре, которую вы не проверяли, он мог бы проявится. Напомню, что киназ насчитывается сотни.

[Vanya Ivanov]

... и выявлять в нем фосфорилированную форму субстрата антителами(дот-блот) Напомню, что киназ насчитывается сотни.

Вот тогда я что то не понимаю Зачем тратится на форез и антитела, если проще отослать в-ва в контору, которая имеет допуски для работы с меченым 31P-АТФ и опыт работы с киназами? Теоретически, подчеркиваю теоретически, отсылая в-ва вы испытываете судьбу. Теряют на почте, инфу воруют конкуренты, но в плюсе скорость и надежность результатов - особенно плохих .

[avor]

Иван! Ну представьте, если бы я начал тем, чем вы закончили. Вопрошающий бы подумал, что тут одни заносчивые снобы, не понимающие насущных потребностей химиков. А так у него перед глазами более менее ясная объективная картина и он может сделать самостоятельный выбор и даже сделал его.
"Спасибо за развернутый ответ, но в таком варианте мы не потянем. Мы же химики, а не микробиологи)"
Т.Е. фактически согласился с вашим предложением. Кстати, из моего общения с коллегами, работающими в иностранных фарм. компаниях недопонимание между химиками и биологами и между биологами и медиками и там являются не до конца решенной проблемой. И в общем представляет одно из осложнений в разработке.

Да и напомню, что 31Р единственный стабильный изотоп фосфора такой удобный для ЯМР и совершенно не подходящий, в качестве радиоактивной метки.

[avor]

http://www.sigmaaldrich.com/content/dam ... 173bul.pdf
вот тут про какой-то набор киназ идет речь и там методика. как я понял, в лунки заряжаем свой раствор с веществом, капаем буфера, потом киназу с атф, а потом на спектрофотометре смотрим интенсивность на 590нм. Это то, что мне нужно?

Не, не так, вам понадобится. Не только киназа, но и ее субстрат(пептид или белок), иначе она ничего не будет кинировать. И используемый прибор - это не фотометр, а флуориметр планшетный, а лучше спектрофлуориметр. Да, и этот кит скорее всего не будет работать(или будет работать плохо) с биологическими средами, содержащими АДФ - это значит, что работа с клеточными экстрактами в данной схеме не надежна или не возможна.

Для одной(или многих) пары "киназа-кинируемый пептид" коммерчески доступных на рынке, я думаю, этот кит вполне валиден. Флюориметр планшетный самый примитивный начинается с 10000 евро Киназы думаю будут под 1000уе десятки микрограм, пептид для киназы типа теже 1000уе, но уже мг. Ну и выбор киназ будет не велик.

[Vanya Ivanov]

..... с биологическими средами, содержащими АДФ - это значит, что работа с клеточными экстрактами в данной схеме не надежна или не возможна....

А чо набор сигмы МАК173 прикольный. Нужно прикупить киназу, пептид-субстрат, обычный Атф, и буфер для киназы. Планшетные ридеры флуориметры - по москве - не проблема.
Все складывается - 2.5 - 3.0 тыс уе. И вперед, тестируйте соединения на киназы.
Зачем биосреды или клеточные экстракты - никак не пойму?

Отскринируют ребята компаунды на чистом белке, а затем отдадут сразу на клетки или на мышки. ... Все научно и адекватно.

[Cherep]

пептид-субстрат надо импортзамещать

[Vanya Ivanov]

Коллеги, а есть у кого то ссылка ни инфу по ферментативной кинетике - атф-субстрат-ингибитор-киназа? Типа обзора .....
Ну там ингибиторы 1 или 2 типа или аллостерический - понятно, а вот с картинками-графиками и методиками?
Интересно, действительно ли химия субстрата так сильно влияет на скорость фосфорилирования?
Это же биология - здесь все мгновенно .... появился серин/треонин на нужного размера "горбике" белковой глобулы и ..... БДЫШ ..! Отфосфорилирован ....

[Nickolas]

А что вы подразумеваете под "химией субстрата"?

[Nickolas]

Кстати, еще один, наверное, самый прямой способ тестирования ингибиторов - HPLC. Немного трудоемкий, зато ничего практически для этого не нужно. Лишь субстрат, киназа, АТФ ну и из оборудования - ВЭЖХ.

[Vanya Ivanov]

А что вэжхой определяли, субстрат-пептид или фосфорилированный пептид? Он стабильный?

[Nickolas]

Если есть подходящий субстрат и подобран градиент, то видно два пика - исходный пептид и продукт. Стабильный, если в растворе нету фосфатаз

Также для тирозинкиназ можно мерять фосфорилирование тирозина по уменьшению абсорбции при 280 нм спектрофотометрически. Но это только если позволяют субстрат и ингибитор - нет поглощения в этой части спектра.

[avor]

Интересно, действительно ли химия субстрата так сильно влияет на скорость фосфорилирования?
Это же биология - здесь все мгновенно .... появился серин/треонин на нужного размера "горбике" белковой глобулы и ..... БДЫШ ..! Отфосфорилирован ....

Вы не с той стороны смотрите на проблему. Смотреть надо исходя из того ДЛЯ ЧЕГО НУЖНО ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ? Т.к. фосфорилирование служит для передачи СПЕЦИФИЧНОГО сигнала. Т.е. путем фосфорилирования активируется та или иная функция субстрата, которая вызывает последовательный каскад реакций, вызывающий СПЕЦИФИЧНЫЙ ответ. И вот тут возникает вопрос, а что если СПЕЦИФИЧНОСТЬ фосфорилирования будет отсутствовать как факт. Тогда любая киназа будет фосфорилировать любой попавшейся под руку серин, треонин, тирозиновый аминокислотный остаток. О какой специфичности передачи сигнала и специфичности ответа на сигнал можно тогда говорить?