Самопереваривание трипсина

[Iskander]

Доброго времени суток!

Возник вопрос по кинетике автопротеолиза трипсина.
Вопрос состоит в следующем: какова скорость автопротеолиза трипсина при различных значениях рН (конкретно 6,5 - 9,5)?
Может у кого есть данные или ссылки где это можно узнать?
Какие ингибиторы автопротеолиза и в каких концентрациях они используются для трипсина?

Из того что я нашел - ситуация невесёлая: стабилизируют ионами кальция (неизвестная концентрация), глицерином (неизвестная концентрация), кислотой (рН<4, но мне это не подходит, так как рабочий для меня диапазон рН - порядка 6,5 - 9,5). Можно стабилизировать ингибиторами протеаз, например соевым, но мне это тоже не подходит.

Можно, конечно, поставить раститровку количества трипсина по времени и определить всё самому, но хочется получить какие-то готовые литературные данные.

[Abwer]

А вот это не смотрел? http://www.chem.msu.su/rus/vmgu/062/87.pdf

[Iskander]

Посмотрел и прибалдел. Особенно от времени проведения эксперимента (180 месяцев!). Вообще-то это не совсем то, но полезные ссылки в этой публикации имеются.

Спасибо.

[avor]

Доброго времени суток!

Возник вопрос по кинетике автопротеолиза трипсина.
Вопрос состоит в следующем: какова скорость автопротеолиза трипсина при различных значениях рН (конкретно 6,5 - 9,5)?
Может у кого есть данные или ссылки где это можно узнать?
Какие ингибиторы автопротеолиза и в каких концентрациях они используются для трипсина?

Из того что я нашел - ситуация невесёлая: стабилизируют ионами кальция (неизвестная концентрация), глицерином (неизвестная концентрация), кислотой (рН<4, но мне это не подходит, так как рабочий для меня диапазон рН - порядка 6,5 - 9,5). Можно стабилизировать ингибиторами протеаз, например соевым, но мне это тоже не подходит.

Можно, конечно, поставить раститровку количества трипсина по времени и определить всё самому, но хочется получить какие-то готовые литературные данные.

рН 4 стандартный способ хранения. Если этого достигать солянкой, то в любом буфере емкостью 20-50мМ это рН практически нивелируется.

Необратимый ингибитор пара-метилсульфонилфторид, и диизопрпилфторфосфат.

Ну можно тупо расфасовать по 10мкл и заморозить.

Ну и самый красивый способ это проттрипсин или трипсиноген, который активируется энтерокиназой, довольно изящно, но дороговато. Протеолизный фон от энторокиназы очень низкий тк она весьма специфична.

[Iskander]

----- рН 4 стандартный способ хранения. Если этого достигать солянкой, то в любом буфере емкостью 20-50мМ это рН практически нивелируется. ------

Это верно, и стоковый раствор я так и храню. Но рабочий раствор должен иметь рН 6,5 - 9,5 и при этом не подвергаться автопротеолизу.

----- Необратимый ингибитор пара-метилсульфонилфторид, и диизопрпилфторфосфат. ------

Меня терзают смутные сомнения.... что диизопропилфторфосфат вызовет нездоровый интерес соответствующих органов. Купить или синтезировать его будет весьма проблематично. Кроме того, это необратимый ингибитор.

Поясню задачу.
Цель - иммобилизовать трипсин на полимерной подложке. Требуется, чтобы он при этом сохранил активность. Иммобилизация - через глутаровый альдегид, соответственно рН 6,5 - 9,5. Но трипсин в этих условиях самопереваривается.

[avor]

----- рН 4 стандартный способ хранения. Если этого достигать солянкой, то в любом буфере емкостью 20-50мМ это рН практически нивелируется. ------

Это верно, и стоковый раствор я так и храню. Но рабочий раствор должен иметь рН 6,5 - 9,5 и при этом не подвергаться автопротеолизу.

----- Необратимый ингибитор пара-метилсульфонилфторид, и диизопрпилфторфосфат. ------

Меня терзают смутные сомнения.... что диизопропилфторфосфат вызовет нездоровый интерес соответствующих органов. Купить или синтезировать его будет весьма проблематично. Кроме того, это необратимый ингибитор.

Поясню задачу.
Цель - иммобилизовать трипсин на полимерной подложке. Требуется, чтобы он при этом сохранил активность. Иммобилизация - через глутаровый альдегид, соответственно рН 6,5 - 9,5. Но трипсин в этих условиях самопереваривается.

----Меня терзают смутные сомнения.... что диизопропилфторфосфат вызовет нездоровый интерес соответствующих органов. Купить или синтезировать его будет весьма проблематично. Кроме того, это необратимый ингибитор.

Ну есть маленько, ну и шо, во первых по каналам Сигмы и не такое протаскивали. А синтезировать, если есть связи в хим защите, на раз.

Но это так - юмор.

По делу.
--Цель - иммобилизовать трипсин на полимерной подложке. Требуется, чтобы он при этом сохранил активность. Иммобилизация - через глутаровый альдегид, соответственно рН 6,5 - 9,5. Но трипсин в этих условиях самопереваривается.

Давайте я вас успокою. Молекула трипсина сама себя не жрет, она жрет соседнюю молекулу трипсина. Так что если она уже заякорилась на матрице, то сама себя жрать не будет.

Даже если трипсин вооще не будет протеолизоваться, то при посадке часть фермента будет терять активность, за счет стерических факторов и химической модификации.

Поэтому если во время посадки часть трипсина потеряется за счет автолиза, то это можно списать просто на потерю активности при посадке.

Что бы уменьшить автолиз можно подразбавить трипсин(в разумных пределах), и взять побольше (для ускорения процесса) матрицы(тоже в разумных пределах, а то удельная активность иммобилизованного трипсина понизится).

Очень часто активированная матрица успешно иммобилизует на себе довольно разбавленный белок, в некотором смысле концентрируя его.

[Iskander]

----- А синтезировать, если есть связи в хим защите, на раз. ------

Синтезировать самому.
Но это злобный чёрный юмор.

Первые пробники показывали неплохую ёмкость по иммобилизованному белку (до 0,5 мг на грамм матрицы), но нулевую ферментативную активность. При этом потеря активности в контрольном растворе составила порядка 55%. По статистике - половина иммобилизованного трипсина также уже денатурировала. Остаток - (даже если списать эффекты химической и стерической дезактивации) процентов 20.

Маловато...
Вот и захотелось поправить ситуацию, устранив хотя бы фактор автолиза.

За советы спасибо, завтра буду пробовать иммобилизацию из разбавленных (кстати, до какой степени) растворов.

[avor]

----- А синтезировать, если есть связи в хим защите, на раз. ------

Синтезировать самому.
Но это злобный чёрный юмор.

Первые пробники показывали неплохую ёмкость по иммобилизованному белку (до 0,5 мг на грамм матрицы), но нулевую ферментативную активность. При этом потеря активности в контрольном растворе составила порядка 55%. По статистике - половина иммобилизованного трипсина также уже денатурировала. Остаток - (даже если списать эффекты химической и стерической дезактивации) процентов 20.

Маловато...
Вот и захотелось поправить ситуацию, устранив хотя бы фактор автолиза.

За советы спасибо, завтра буду пробовать иммобилизацию из разбавленных (кстати, до какой степени) растворов.

---Синтезировать самому.
Но это злобный чёрный юмор.
Зачем же самому, если есть связи в академии хим. защиты.

---По статистике - половина иммобилизованного трипсина также уже денатурировала.

Это как?

--При этом потеря активности в контрольном растворе составила порядка 55%.

Что вы называете контролльным раствором?

И еще наводящий вопрос: вы иммобилизацию проводите смешивая все вместе - матрицу, глютар и трипсин или сначала активируете матрицу глютаром, потом промываете и добавляете трипсин?

Матрица гидрофобная?

И общее место: для повышения активности иммобилизуемого белка уменьшают общую концентрацию активированных центров на матрице и общую концентрацию на матрице иммобилизуемого белка.

[Iskander]

------ По статистике - половина иммобилизованного трипсина также уже денатурировала.

Это как? -------

Ну, мёртвый белок это всё равно белок. И клеиться за аминогруппы он будет ничуть не хуже чем живой. Поэтому логично предположить, что половина иммобилизованного белка является яичницей.

Контрольный раствор - это стоковый раствор трипсина, разбавленный тем же буфером для иммобилизации, но без добавления активированной матрицы. Приготовлен одновременно с рабочими и корректно отражает что там происходит помимо иммобилизации. (в смысле побочные процессы)

------ И еще наводящий вопрос: вы иммобилизацию проводите смешивая все вместе - матрицу, глютар и трипсин или сначала активируете матрицу глютаром, потом промываете и добавляете трипсин? -----

Сначала матрица активируется глутаром, затем отмывается и затем туда добавляется трипсин

----- Матрица гидрофобная? -----

Не очень. Наверное что-то среднее между полистиролом и целлюлозой. Краевой угол я не мерял. Вообще, водой смачивается легко, но заметная неспецифика есть.

----- И общее место: для повышения активности иммобилизуемого белка уменьшают общую концентрацию активированных центров на матрице и общую концентрацию на матрице иммобилизуемого белка. ------

Так то оно так, но хочется и белка побольше и чтоб поживее был.

[avor]

Ну что могу посоветовать подразбавить белок при нанесении.

[pH<7]

Ещё такая фишка есть:
Trypsins should be stored at very cold temperatures (between −20°C and −80°C) to prevent autolysis (self-cleavage). Autolysis may also be prevented by storage of trypsins at pH 3 or by using trypsin modified by e.g. reductive methylation. When the pH is adjusted back to pH 8 activity returns.

Необратимый ингибитор пара-метилсульфонилфторид

это кто?

[avor]

Необратимый ингибитор пара-метилсульфонилфторид

это кто?

точно! ошибся я и в названии ошибка и в молекуле

фенилметил(возможно правильней метилен)сульфонилфторид

--Trypsins should be stored at very...

Это мы уже с Искандером уже обсудили. Проблема не в хранении, а в том, что при иммобилизацию на матрице к сожалению при таких рН и температурах ничего не иммобилизуеца(по понятным причинам)

А вот при условиях иммобилизации трипсин, за время пока она идет, к сожалению успевает себя покушать.

[pH<7]

А на самом деле - неужели никто трипсин не иммобилизовал? Гуглится "trypsin immobilization", например http://dx.doi.org/10.1016/j.msec.2005.07.020

[Iskander]

----- А на самом деле - неужели никто трипсин не иммобилизовал? -----

Иммобилизовали, конечно. Но всегда указывается сравнительно невысокая сохранность белка. (Например, БСА - налил 1 мг/мл, после иммобилизации - 0,5 мг прилипло, 0,5 мг смылось. Функции более-менее сохранились. А трипсин - 0,5 мг прилипло и из этого половина потеряла активность)

Кроме того:

optimum value of 958.0 mg trypsin/g dried particles and 372.5 mg EDC/g dried.

Это КАК 1 грамм трипсина на 1 грамм матрицы?

Ещё один момент. Там цепляли за карбоксилы через EDC.
Я пока работаю с глутаром (хотя, при наличии отсутствия результата, перейду на другие способы активации матрицы).

Ну и наконец, получить дважды одинаковый полимер так же невозможно, как дважды войти в одну реку. Тем более что матрица у меня не акриловая, а скорее алкидная. Но за ссылку всё равно спасибо.

[Iskander]

Потыкался по-разному.

Трипсин просто мрёт самостоятельно. Прям как ляжет на матрицу, так и копец. Ёмкость образцов по белку высокая (до 4 мг/г), примерно в 10 раз больше, чем даёт неспецифика, то есть иммобилизуется он правильно.

Но белок мрёт.

Видимо надо переходить на КДИ.

[avor]

Потыкался по-разному.

Трипсин просто мрёт самостоятельно. Прям как ляжет на матрицу, так и копец. Ёмкость образцов по белку высокая (до 4 мг/г), примерно в 10 раз больше, чем даёт неспецифика, то есть иммобилизуется он правильно.

Но белок мрёт.

Видимо надо переходить на КДИ.

Я ж говорю: Главная проблема в иммобилизации а не самопрерваре.

[Вольфберг]

может, конечно, и некропост, но есть патент на иммобилизирование некоторых протеолитических ферментов.

Код: Выделить всё

 http://www.science-education.ru/107-8352

Код: Выделить всё

http://www.findpatent.ru/patent/200/2008354.html

[Cherep]

прямые ссылки запрещены. пользуйтесь тэгом code

[Дмитрий Подкопаев]

А если до начала посадки на матрицу к трипсину добавить большое количество субстрата? По идее субстрат прикроет активный центр и возможно снизит потери из-за денатурации и самопереварки. Субстрата надо взять больше чем фермента, чтобы полностью перекрыть активные центры и успеть провести иммобилизацию. Однако что взять за субстрат? Если белок, то, его очень много сядет на матрице и ее потом придется отмывать еще и от защитного белка. Есть инфа, что трипсин обладает эстеразной активностью. Может взять сложные эфиры?

[dan14444]

вязать трипсиноген и активировать потом...
хуже, что от глутарной привязки он дохнет - способов обойти много, но дешёвого я не вижу... кди вряд ли помогут - на те же амины вяжуццо.