Анализ связывания 1,8-АНС с альбумином (интерпретация)

[Demiurg]

Здравствуйте уважаемые участники форума!

Хотелось бы обратиться к Вам за помощью в деле интерпретации и понимания результатов эксперимента по связыванию флуоресцентного зонда 1-анилино-8-нафталинсульфоновой кислоты (1,8-АНС) с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Суть методики - при связывании зонда с белком, интенсивность его флуоресценции резко возрастает (в сравнении с таковой в несвязанном состоянии, точнее при нахождении в полярной среде).
БСА (в постоянной концентрации 0,5 мг/мл, находящийся в физ. растворе) титровался переменной концентрацией зонда (конечная концентрация зонда в реакционной смеси - от 5 до 75 мкМ). Реакционная смесь инкубировалась 30 мин. для полного завершения процессов связывания. После чего проводилось измерение интенсивности флуоресценции. Собственная флуоресценция 1,8-АНС учитывалась с помощью параллельно поставленной калибровочной кривой для свободного 1,8-АНС (идентичные концентрации в отсутствии белка). Интенсивность флуоресценции свободного 1,8-АНС вычитались из таковых для связанного зонда.
В итоге получилась типичная гиперболическая зависимость (аналогичная классической ферментативной кинетике Михаэлиса-Ментен). Для анализа данной зависимости использовалась программа GraphPad Prism. Обработка проводилась с помощью процедуры One site - total binding (http://www.graphpad.com/guides/prism/6/ ... _total.htm). Предпосылки такого выбора - связывание 1,8-АНС с альбумином носит неспецифический характер, в молекуле альбумина присутствует только один центр связывания.
Мне непонятны некоторые моменты по интерпретации полученных результатов:
1. как понимать и интерпретировать параметр Bmax, в данном случае являющейся максимальной интенсивностью флуоресценции (аналогичным которому является параметр Vmax в кинетике Михаэлиса-Ментен)? Можно ли его понимать и интерпретировать как связывающую емкость центра связывания молекул зонда на альбумине, т.е. сводить его к максимальной концентрации 1,8-АНС, связывающейся с альбумином (нормированной на его концентрацию и выраженной в мкМ/мг БСА)? Допустим, Bmax составляет 93673 RFU (Relative fluorescence units), что будет - на основе полученной зависимости инт. флуоресценции от кол-ва добавленного к альбумину 1,8-АНС - соответствовать тому, как если бы с альбумином связалось ну где-то 160 мкМ 1,8-АНС (при его концентрации в 0,5 г/л). Т.е. Bmax = 160 нМ 1,8-АНС/мг альбумина? Была мысль проанализировать данную зависимость в координатах Скэтчарда, но в таком случае нужно знать не просто общее количество внесенной метки (зонда), но - конкретно - сколько ее связалось с альбумином. Как в данном случае это узнать - не знаю (это ведь не радиолигандный анализ)...
2. Как понимать и интерпретировать параметр Kd, в данном случае являющийся Константой диссоциации комплекса альбумин-1,8 АНС (аналогичным которому является параметр Km в кинетике Михаэлиса-Ментен)? Насколько мне известно, что меньше Константа Михаэлиса (для конкретного субстрата и конкретного фермента), тем больше сродство данного фермента к данному субстрату. Можно ли в данном случае (на основе значения Kd) говорить о том, что меньше значение Kd, тем выше сродство центра связывания к молекулам 1,8-АНС, и наоборот?
Извиняюсь за дилетантские измышления (методология для меня новая, как говорится "я ведь еще только учусь!"). Буду рад любым комментариям и замечаниям!

[Vanya Ivanov]

Хотелось бы обратиться к Вам за помощью в деле интерпретации и понимания результатов эксперимента по связыванию флуоресцентного зонда 1-анилино-8-нафталинсульфоновой кислоты (1,8-АНС) с бычьим сывороточным альбумином (БСА). ........ Извиняюсь за дилетантские измышления (методология для меня новая, как говорится "я ведь еще только учусь!"). Буду рад любым комментариям и замечаниям!

К ферментативной кинетике эти экзорциссы отношения не имеют ...т.к. у вас кол-во сорбата не изменяется. Ну вероятно тот кто планировал этот эксперимент ЧТО-ТО объяснял? Правильно? А кто то что-то не дослушал, наверное?
Эти результаты описываются уравнениями сорбции: Ленгмюра, Френдлиха или БЭТ и тп.
ТУТА ПРИМЕРЧИК:

2014_04_04.pdf

[Demiurg]

Спасибо!
Но, честно говоря, мало что понял. Позвольте у Вас, хотя бы, выяснить, что такое СОРБАТ? То, что сорбирует или то, что сорбируется (проще говоря, сорбат - это альбумин, или 1,8-АНС?)? Я так полагаю, что сорбат - это альбумин (именно его концентрация не меняется).
Авторы статьи добавляли к сорбенту различные концентрации пиридоксина и определяли сколько его при конкретных начальных концентрациях связывается, а сколько остается свободным. Так обычно и делают при изучении всяких там лиганд-рецепторных взаимодействий (в давние-давние времена и у нас в лабе занимались подобного рода радиолигандными измерениями: выделяли рецепторы, нормировали образцы по белку и инкубировали их с разными концентрациями (обычно) тритий-меченного лиганда или его аналогом, затем отделяли белок и на жидкостно-сцинтилляционном анализаторе измеряли активность безбелковой фазы). На основе таких данных и находили искомые параметры (константу диссоциации и емкость связывания, т.е. Bmax), обычно в координатах Скэтчарда.
Я, честно говоря, не вполне себе представляю, как мне - на основе флуоресцентных измерений - определить именно количество связавшегося (сорбировавшегося) с альбумином 1,8-АНС. Может быть, можно сделать что-то вроде такого: сначала проинкубировать альбумин (в постоянной концентрации) с переменными (в каком-то диапазоне, так чтобы его верхнего предела хватило для насыщения и выхода потом кривой на плато) концентрациями 1,8-АНС, затем отделить белок (осаждением ТХУ, спиртом или чем-то подходящим) и в безальбуминовой фазе определить концентрацию 1,8-АНС (по флуоресценции или же, может быть, по оптическому поглощению). Опять же, я не знаю, можно ли определить сколько 1,8-АНС связалось на основе изменения интенсивности флуоресценции (наверное, нет).
Не сочтите за труд, Вы (да и вообще все кто может) мне, будьте добры, разъясните. "Я так считаю. Если я не правильно считаю, пусть старшие товарищи меня поправят".

[Nickolas]

Предпосылки такого выбора - связывание 1,8-АНС с альбумином носит неспецифический характер, в молекуле альбумина присутствует только один центр связывания

А не может быть, что там несколько центров связывания?

[uchebnik fiziki]

Как раз неспецифическое связывание предполагает, что не существует единственного или даже нескольких конкретных центров связывания.

[Demiurg]

В Практикуме по биохимии под ред. Северина (1989 .г., изд-во МГУ), на с.366-367, приводится краткое изложение методики по анализу связывания 1,8-АНС с мембранами саркоплазматического ретикулюма скелетных мышц. Суть та же - препараты мембран (нормированные по белку) титруют переменными концентрациями 1,8-АНС (5-75 мкМ). Сказано, что нужно строить график в координатах 1/F (F - интенсивность флуоресценции) от 1/[ANS] ([ANS] - концентрация 1,8-АНС). Сказано также, что в этих координатах находят Fmax (макс. интенсивность флуоресценции) и КАЖУЩУЮСЯ КОНСТАНТУ ДИССОЦИАЦИИ (комплекса 1,8-АНС-мембраны) В кинетике Михаэлиса-Ментен - это т.н. двойные обратные координаты или координаты Лайнуивера-Берка (Y - 1/v, X - 1/S).
1,8-АНС связывается с альбумином в определенных центрах связывания, а не просто тотально сорбируется на белковую глобулу. Другое дело, что я не скажу точно, сколько таких центров связывания (из доступных мне лит. источников - один). Под неспецифическим характером связывания я подразумевал то, что это связывание не селективно (в эти центры связывания альбумина относительно много чего вообще может связываться, все-таки это не рецептор и его специфичный лиганд). Но, тем не менее, есть именно центры связывания, а не сорбция на молекулу.