Гидролиз белка

вопросы современной биологической химии, молекулярной биологии, химической энзимологии и смежных наук
biochem, molbio, chemical enzymology and related discussions for professionals
Аватара пользователя
avor
Сообщения: 10471
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Гидролиз белка

Сообщение avor » Пн сен 12, 2016 4:12 pm

--Ну, тогда растворы чистых аминокислот должны быть кислыми, а это не так.
Вы в этом уверены? Я точно знаю, что глицином закисляют раствор трис-(гидроксиметила)аминометана

Аватара пользователя
chemist
Сообщения: 8394
Зарегистрирован: Пн июл 26, 2004 2:14 am

Re: Гидролиз белка

Сообщение chemist » Пн сен 12, 2016 4:14 pm

Arrenius писал(а):Ну после приготовления суспензии белка в воде рН где то 6, я довожу до оптимального 7,5 и после прибавления фермента поддерживаю прикапывая либо аммиак либо слабую щелочь. Так что какой рН после ферментации не знаю, т.к. сам его регулирую.
Что значит "либо-либо", что добавляете на самом деле-то и сколько?
Arrenius писал(а): Было только одно обратное титрование, второе не делал, т.к. не вижу в нем смысла. Скачки не различимы.
Зря. А титрант не мешало бы проверить, т.к. подозрительно это.
Arrenius писал(а): все что я добавлю в раствор (буферы, протекторы и т.д.) останется в товарном продукте, что не есть хорошо.
А "аммиак либо слабая щелочь", значит, есть хорошо? :wink:
I D E A = A u

Аватара пользователя
chemist
Сообщения: 8394
Зарегистрирован: Пн июл 26, 2004 2:14 am

Re: Гидролиз белка

Сообщение chemist » Пн сен 12, 2016 4:16 pm

avor писал(а): Вы в этом уверены? Я точно знаю, что глицином закисляют раствор трис-(гидроксиметила)аминометана
Не закисляют, а доводят до нормы, т.к. сам по себе раствор ТРИСа довольно щелочной (в районе 10).
I D E A = A u

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 10471
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Гидролиз белка

Сообщение avor » Пн сен 12, 2016 4:37 pm

chemist писал(а): Не закисляют, а доводят до нормы, т.к. сам по себе раствор ТРИСа довольно щелочной (в районе 10).
Я рад что вы меня поняли, несмотря на мою попытку ввести вас в заблуждение. :lol:

На самом деле не совсем до нормы(хотя что такое "норма"), а где-то до рН-8,3, но с 10 или даже более высокой. Но в любом случае рН понижают.

Аватара пользователя
Гесс
Сообщения: 10690
Зарегистрирован: Ср фев 15, 2012 11:19 pm

Re: Гидролиз белка

Сообщение Гесс » Пн сен 12, 2016 4:47 pm

chemist писал(а):
avor писал(а): Вы в этом уверены? Я точно знаю, что глицином закисляют раствор трис-(гидроксиметила)аминометана
Не закисляют, а доводят до нормы, т.к. сам по себе раствор ТРИСа довольно щелочной (в районе 10).
Ну с изоэлектрической точкой 5.97 - можно и закислять, хотя если 5.5 6 это "норма"...

Аватара пользователя
Arrenius
Сообщения: 155
Зарегистрирован: Ср дек 19, 2007 11:02 pm

Re: Гидролиз белка

Сообщение Arrenius » Вт сен 13, 2016 11:21 am

chemist писал(а):
Arrenius писал(а):Ну после приготовления суспензии белка в воде рН где то 6, я довожу до оптимального 7,5 и после прибавления фермента поддерживаю прикапывая либо аммиак либо слабую щелочь. Так что какой рН после ферментации не знаю, т.к. сам его регулирую.
Что значит "либо-либо", что добавляете на самом деле-то и сколько?
В первых экспериментах прикапывал аммиак, т.к. в случае сушки или упаривания его избыток просто улетучится, но в последних рН уже равнял щелочью. Не могу точно обосновать почему, но просто почесав левой рукой правое ухо, подумал что натриевые соли карбоновых кислот, все таки более часто встречаются в пищевой промышленности, чем аммонийные. :) Количество тоже не засекаю, просто прикапываю до оптимального рН и все.
chemist писал(а):Зря. А титрант не мешало бы проверить, т.к. подозрительно это.
Проверить на что??? На концентрацию? Даже если допустим там плюс миную 5% на что это повлияет? Скачки не делятся.
chemist писал(а):А "аммиак либо слабая щелочь", значит, есть хорошо? :wink:
А что в них плохого, если они расходуются только на солеобразование с карбокси группами и избытка нет? Т.е. самой щелочи в сухом продукте после сушки не будет.

Аватара пользователя
chemist
Сообщения: 8394
Зарегистрирован: Пн июл 26, 2004 2:14 am

Re: Гидролиз белка

Сообщение chemist » Вт сен 13, 2016 1:12 pm

Arrenius писал(а):просто почесав левой рукой правое ухо
Количество тоже не засекаю, просто прикапываю до оптимального рН и все.
Это несерьёзно, т.к. наука начинается там, где есть измерения. А Ваши манипуляции с ушами и руками пусть объясняют родные и близкие :D
Arrenius писал(а):
chemist писал(а):Зря. А титрант не мешало бы проверить, т.к. подозрительно это.
Проверить на что??? На концентрацию? Даже если допустим там плюс миную 5% на что это повлияет? Скачки не делятся.
Не надо ничего допускать, просто проверить стандарт-титром и всё!
Скачки не обязаны делиться, а вот точка эквивалентности может сдвинуться и её значение - основа для расчётов :up:
I D E A = A u

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 10471
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Гидролиз белка

Сообщение avor » Вт сен 13, 2016 6:00 pm

ЭЭЭ! Летучий буфер с относительно близкой к физиологическим рН пиридин ацетатный. Не дешев, но. Пиридин 100мл ЛУК-4 мл довести до литра рН=6,5, думаю можно разбавить еще больше.
Аммония бикарбонат в районе концентраций 25-60мМ буферит в районе 8 Дешево и сердито очень популярно.

Аватара пользователя
Arrenius
Сообщения: 155
Зарегистрирован: Ср дек 19, 2007 11:02 pm

Re: Гидролиз белка

Сообщение Arrenius » Вт сен 13, 2016 7:18 pm

Спасибо за совет! Может скоро пригодится!
Мне рН 7,5 нужен, так что ацетат пиридина наверно не очень подходит.

Аватара пользователя
Arrenius
Сообщения: 155
Зарегистрирован: Ср дек 19, 2007 11:02 pm

Re: Гидролиз белка

Сообщение Arrenius » Чт сен 15, 2016 4:05 pm

А подскажите, как вообще можно определить белок денатурированный или нет?

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 10471
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Гидролиз белка

Сообщение avor » Чт сен 15, 2016 5:26 pm

Arrenius писал(а):А подскажите, как вообще можно определить белок денатурированный или нет?
Ну я знаю два более или менее надежных способа.
1)По активности(например ферментной)
2)По изменению спектра кругового дихроизма, но здесь нужен спектр нативного не денатурированного белка в качестве стандартного образца сравнения.

Так же на денатурацию могут реагировать спектры флуоресценции белка, изменяется гидродинамический радиус, но эти изменения могут быть и заметными, и не очень, зависит от конкретного белка.

Аватара пользователя
Arrenius
Сообщения: 155
Зарегистрирован: Ср дек 19, 2007 11:02 pm

Re: Гидролиз белка

Сообщение Arrenius » Чт сен 15, 2016 7:57 pm

Ужас!)))
Ладно, зайду с другой стороны. Когда я провожу гидролиз в довольно разбавленной суспенции, то вроде все нормально, но когда я пытаюсь подобрать наименьшее количество воды при котором процесс таки идет, то если после видимого окончания реакции (примерно час) оставить при перемешивании реакционную смесь на продолжительное время при нагреве, то она начинает коричневеть и сильно густеть, вплоть до образования пластилиноподобной массы. Вот я и думаю не денатурация ли это непрореагировавшего белка?

Аватара пользователя
chemist
Сообщения: 8394
Зарегистрирован: Пн июл 26, 2004 2:14 am

Re: Гидролиз белка

Сообщение chemist » Чт сен 15, 2016 9:41 pm

Если температура не высокая, то всякая микроживность может завестись :shock: :shock: :shock:
Их можно рассмотреть в микроскоп :watchin:
I D E A = A u

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 10471
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Гидролиз белка

Сообщение avor » Чт сен 15, 2016 11:40 pm

Arrenius писал(а):Когда я провожу гидролиз в довольно разбавленной суспенции, то вроде все нормально, но когда я пытаюсь подобрать наименьшее количество воды при котором процесс таки идет, то если после видимого окончания реакции (примерно час) оставить при перемешивании реакционную смесь на продолжительное время при нагреве, то она начинает коричневеть и сильно густеть, вплоть до образования пластилиноподобной массы. Вот я и думаю не денатурация ли это непрореагировавшего белка?
Денатурация практически на 100% здесь не причем. Покоричневение, это почти с уверенностью можно сказать, результат карамелизации( результат реакции аминогрупп аминокислот с альдегидными группами примесных сахаров). Так же карамелизация частично пособствует загущению. Но больше всего, я подозреваю, что загущению способствует либо набухание и ратворение зерен примеси крахмала. Либо набухание и растворение зерен суспензии белка.

hongma
Сообщения: 335
Зарегистрирован: Пн апр 18, 2005 10:56 pm

Re: Гидролиз белка

Сообщение hongma » Пт сен 16, 2016 3:24 pm

Лишь немногие протеазы (вроде Проназы и Протеиназы К) способны гидролизовать до аминокислот.
Что же касается хода гидролиза...
Титрование - не самый лучший способ :)
Поскольку исходный белок, насколько можно судить, плохо растворим и смесь мутная, то удобно смотреть по просветлению раствора.Короткие полипептиды растворимее исходных белков. Есть даже такая экспресс-методика определения активности протеиназ по "яичному молоку". То есть разбавленный яичный белок нагревают почти до кипения и он мутнеет. От протеиназ такая суспензия просветляется и по времени достижения эталонной прозрачности можно судить об активности фермента. Из оборудования нужны - пипетки,пробирки и газета (смотреть читаемость шрифта через пробирку).

Второй вариант - осаждаем белок кислотой (любой, хотя бы соляной. обычно берут трихлоруксусную или хлорную), центрифугируем. Осадок растворяем в щелочи и определяем белок любым подходящим методом. Например биуретовым. По мере гидролиза доля осаждаемого белка падает.

Ответить

Вернуться в «биохимия и молекулярная биология / biochemistry and molecular biology»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: Google [Bot] и 4 гостя