Гидролиз белка

[chemist]

Нет, не должны. Они титруются позже, поэтому лишь слегка изменят хвост кривой системы HCl-NaOH, но на её точку эквивалентности не повлияют. Можете убедиться в этом, добавив, например, аминокислоту глицин.

[Arrenius]

Ну если титруете чистую аминокислоту обратным титрованием, то конечно пики скорее всего разделяться. А если такая смесь из 20ти аминокислот и бесчисленного множества пептидов как у меня, то разве они не могут оттитроваться одновременно? Ну или если не одновременно, то слиться так, что их уже не различишь. У меня реально один большой скачок. Если нужно, кривую могу выложить.

[chemist]

Обсчитайте этот скачок.

[Arrenius]

Обсчитал! На нейтрализацию всей добавленной кислоты должно было пойти 49мл щелочи, а пошло 50. Вот этот один мл погрешность или карбоксильные группы протитровались?

[chemist]

Чтобы это узнать, надо сделать глухой опыт, см. выше.
Кстати, для полноты картины неплохо бы сделать обратное титрование наоборот - добавить известный избыток щёлочи и оттитровать кислотой.

[Arrenius]

А кто знает почему при ферментативном гидролизе падает рН? Ведь количество кислотных и основных групп при гидролизе образуется одинаковое количество.

[avor]

А у вас гидролиз идет просто в воде или вы все таки какой то буфер добавляете в реакционную смесь? И чтовы пдразумеваете под словом "падает"

[chemist]

Зависит от аминокислотного состава белка, если в нём много аспарагиновых и глутаминовых остатков, то гидролизат будет кислым, если же много лизинов и гистидинов, то щелочным.

[Arrenius]

А у вас гидролиз идет просто в воде или вы все таки какой то буфер добавляете в реакционную смесь? И чтовы пдразумеваете под словом "падает"

Никакого буфера не добавляю, просто в воде. Ну падает значит опускается, а я не даю ему это делать прикапывая щелочь.

Зависит от аминокислотного состава белка, если в нём много аспарагиновых и глутаминовых остатков, то гидролизат будет кислым, если же много лизинов и гистидинов, то щелочным.

У лизина например, одна аминогруппа и так свободна с самого начала и в изменениях рН в процессе гидролиза участия не принимает.

[chemist]

У лизина например, одна аминогруппа и так свободна с самого начала

Как Вы это установили, Вам известно точное строение белков, которые гидролизуете?

[Arrenius]

Как Вы это установили, Вам известно точное строение белков, которые гидролизуете?

Какая разница какое строение белка? Гидролизуются только пептидные связи, т.е. образуется амино и кислотных групп поровну. Все остальные, сколько бы их не было, были свободные изначально и в процессе гидролиза не образовываются.

[chemist]

были свободные изначально

Откуда это известно?

[kika]

А кто знает почему при ферментативном гидролизе падает рН? Ведь количество кислотных и основных групп при гидролизе образуется одинаковое количество.

Вы гидролиз в закрытой посудине проводите? Иногда в кислом рН углекислый газ подозревают.

[Arrenius]

были свободные изначально

Откуда это известно?

Вы представляете как вообще белок устроен? Одна амино- и одна карбокси- группы в каждой кислоте связаны в пептидные связи для построения белковой цепи, все остальное болтается свободным.

[chemist]

Свободными, значит говорите, являются боковые функциональные группы белка. А где это написано? И как же, например, дисульфидные мостики, в которых боковые SH-цистеина заблокированы?

[Arrenius]

Свободными, значит говорите, являются боковые функциональные группы белка. А где это написано? И как же, например, дисульфидные мостики, в которых боковые SH-цистеина заблокированы?

Ну некоторые заблокированны, но они ферментом не деблокируются, те которые не блокированы так и остаются не блокированными.

[chemist]

Ну некоторые заблокированны, но они ферментом не деблокируются, те которые не блокированы так и остаются не блокированными.

Вся проблема в том, что неизвестно строение Вашего белка, поэтому имеют право на жизнь любые гипотезы, включая банальное поглощение СО2 из воздуха. Кстати, какие значения рН до и после ферментации? И что показало второе обратное титрование?

[avor]

Выскажу гипотезу причин закисления. Большинство карбоксильных групп аминокислот имеют рК в районе 2,5-3, а большинство образующихся альфа аминогрупп рК 9,5-10. Что бы компенсировать образующиеся кислотные группы аминогруппам надо бы иметь рК в районе 11- 11,5, а это вот не получается.
Что касается непосредственно процесса протеолиза, то обычно его стараются проводить не в воде, а в более контролируемой среде. Там присутствуют кофакторы фермента(например двухвалентные катионы металлов или SH протекторы и буфер поддерживающий рН в оптимальном интервале, ну и еще добавки облегчающие доступ фермента к пептидным связям.

[Arrenius]

Кстати, какие значения рН до и после ферментации? И что показало второе обратное титрование?

Ну после приготовления суспензии белка в воде рН где то 6, я довожу до оптимального 7,5 и после прибавления фермента поддерживаю прикапывая либо аммиак либо слабую щелочь. Так что какой рН после ферментации не знаю, т.к. сам его регулирую.
Было только одно обратное титрование, второе не делал, т.к. не вижу в нем смысла. Скачки не различимы.

Выскажу гипотезу причин закисления. Большинство карбоксильных групп аминокислот имеют рК в районе 2,5-3, а большинство образующихся альфа аминогрупп рК 9,5-10. Что бы компенсировать образующиеся кислотные группы аминогруппам надо бы иметь рК в районе 11- 11,5, а это вот не получается.

хм.....звучит очень правдоподобно....спасибо!

Что касается непосредственно процесса протеолиза, то обычно его стараются проводить не в воде, а в более контролируемой среде. Там присутствуют кофакторы фермента(например двухвалентные катионы металлов или SH протекторы и буфер поддерживающий рН в оптимальном интервале, ну и еще добавки облегчающие доступ фермента к пептидным связям.

Дело в том, что пока это конечно лабораторные эксперименты и можно делать что угодно, но при удачном стечении обстоятельств будет собрана полупромышленная установка конечной целью является сухой(!) прегидролизованный белок. Пока вариантов сушки, кроме распылительной сушилки не вижу (может быть еще волковая), но в обоих случаях все что я добавлю в раствор (буферы, протекторы и т.д.) останется в товарном продукте, что не есть хорошо.
Ну и по времени падения рН я могу оценивать хоть как то скорость и продолжительность работы фермента, если будет буфер, то я почти ничего не узнаю.

[chemist]

Выскажу гипотезу причин закисления. Большинство карбоксильных групп аминокислот имеют рК в районе 2,5-3, а большинство образующихся альфа аминогрупп рК 9,5-10. Что бы компенсировать образующиеся кислотные группы аминогруппам надо бы иметь рК в районе 11- 11,5, а это вот не получается.

Ну, тогда растворы чистых аминокислот должны быть кислыми, а это не так.