Гидролиз белка

[Arrenius]

Добрый день!
Пытаюсь гидролизовать растительный белок ферментом. Как можно судить о степени завершенности реакции? Сам белок нерастворим, а аминокислоты все в воде растворимы? Т.е. по идее, когда реакция пройдет на 100% мутная суспензия должна превратится в прозрачный раствор?

Можно ли как то судить о степени прохождения реакции? Чем более завершенная реакция тем больше в растворе амино- и карбокси-групп, может их можно титровать?
Спасибо!

[avor]

Растительный белок - это глютен? А фермент (песин?). По опыту совсем чтоб без суспензии не получится, очень адский фермент должен быть. Конечно количество аминогрупп в растворе должно расти. Наверное наиболее приемлема цветная реакция с нингидрином. Количество определяется спектрофотометрически.

[Arrenius]

Растительный белок - это глютен? А фермент (песин?). По опыту совсем чтоб без суспензии не получится, очень адский фермент должен быть. Конечно количество аминогрупп в растворе должно расти. Наверное наиболее приемлема цветная реакция с нингидрином. Количество определяется спектрофотометрически.

Да, глютен, а фермент какая то протеаза ненашинская.
А совсем без суспензии не получится почему? Потому что фермент не сможет до конца гидролизовать? Т.е. с кислотой например получился бы раствор?
Спасибо за подсказку о нингидрине, почитаю что это за зверь.
Думаю оттитровать таки не получится, потому что группы очень разные и скачок скорее всего будет размыт на большом диапазоне рН.((

[avor]

Гафтно эти не нашинские протеазы(обычно для пищевки выпускаются).

-А совсем без суспензии не получится почему? Потому что фермент не сможет до конца гидролизовать?
Именно! Не сможеть! И дело тут не только в слабости фермента(хотя и в ней тоже), но и в недоступности ферменту сайтов гидролиза, находящихся внутри твердых зерен субстрата.

- Т.е. с кислотой например получился бы раствор?
И это тоже вряд ли. Что бы кислотой получился раствор нужна запаянная ампула и температура 140 градусов с соответствующим давлением и все это сутки парить жарить.

--Думаю оттитровать таки не получится, потому что группы очень разные и скачок скорее всего будет размыт на большом диапазоне рН.((
Совершенно верно с учетом того, что там еще и пептиды будут в 2-5 аминокислоты диапазон перекрываемых рН может быть от 3 до 10.

[chemist]

Думаю оттитровать таки не получится, потому что группы очень разные и скачок скорее всего будет размыт на большом диапазоне рН.((

Можно оттитровать обратным титрованием - добавить точный избыток сильной кислоты, которую оттитровать щёлочью, при этом скачок будет уже большим.

[Arrenius]

Можно оттитровать обратным титрованием - добавить точный избыток сильной кислоты, которую оттитровать щёлочью, при этом скачок будет уже большим.

Точно! И че я сам не додумался? ))) Только проблема в том, что это суспензия.....насколько она будет адекватно титроваться не понятно.

Именно! Не сможеть! И дело тут не только в слабости фермента(хотя и в ней тоже), но и в недоступности ферменту сайтов гидролиза, находящихся внутри твердых зерен субстрата.

Начитался что нашел про протеазы, судя по всему они вообще не предназначены для гидролиза белков до аминокислот. Только до пептидов небольших. Они, тоже не ратворимы в воде, так что получается процесс "бигетерогенный"? Как такое вообще может быть?))))

[avor]

--Точно! И че я сам не додумался? ))) Только проблема в том, что это суспензия.....насколько она будет адекватно титроваться не понятно.
Скачек то это повысит, а вот определить вы ничего точно не сможете.И дело не в том, что это суспензия. У вас самое интересное начнется вблизи точки эквивалентности по добавленной кислоте, а там будет почти плавная кривая без скачков, А именно по разнице этой кривой и кривой с чистой водой определяется количество, а на вашей кривой зацепиться будет не за что. Что касается анализа глубины гидролиза по кривой титрования, то наверное его можно делать если создать некую эталонную кривую, которую показывает гидролизат необходимого качества, но например для другой протеазы -эта эталонная кривая может оказаться другой.

--Начитался что нашел про протеазы, судя по всему они вообще не предназначены для гидролиза белков до аминокислот. Только до пептидов небольших. Они, тоже не ратворимы в воде, так что получается процесс "бигетерогенный"? Как такое вообще может быть?))))

Да, нет пептиды в большинстве своем растворимы.

[chemist]

У вас самое интересное начнется вблизи точки эквивалентности по добавленной кислоте, а там будет почти плавная кривая без скачков

Это ещё почему? Всю жизнь титрую и никаких таких проблем никогда не наблюдалось, скачки чёткие. Не может слабое основание повлиять на ход титрования сильной кислоты!

А именно по разнице этой кривой и кривой с чистой водой определяется количество, а на вашей кривой зацепиться будет не за что.

А воду-то зачем титровать?

Что касается анализа глубины гидролиза по кривой титрования, то наверное его можно делать если создать некую эталонную кривую, которую показывает гидролизат необходимого качества, но например для другой протеазы -эта эталонная кривая может оказаться другой.

Какая такая "эталонная кривая", нет такого понятия в титрометрии! Кофейная гуща даст гораздо более точный результат, если уж на то пошло

[avor]

Если у вас там находится сотня разных оснований и кислот в разных концентрациях с рК отличающемся на десятые единицы рН то еще как может. Если у вас их мало по отношению к сильной кислоте, то вы просто не поймете сколько их на фоне скачка рН сильной кислоты, а если много они растянут у вас скачек рН в точке эквивалентности по сильной кислоте на пологую кривую неопределенной формы. Я имел дело с такими смесями.
-Какая такая "эталонная кривая", нет такого понятия в титрометрии!
Конечно нет, но в данном случае мы имеем дело с объектом, для которого понятия классической аналитической титрометрии просто неприменимы.

[Arrenius]

Что касается анализа глубины гидролиза по кривой титрования, то наверное его можно делать если создать некую эталонную кривую, которую показывает гидролизат необходимого качества, но например для другой протеазы -эта эталонная кривая может оказаться другой.

Какая такая "эталонная кривая", нет такого понятия в титрометрии! Кофейная гуща даст гораздо более точный результат, если уж на то пошло

Как ни странно, у меня именно такая ситуация. Есть вещество в чистом виде, которое нужно получить. И теоретически по кривым титрования можно будет косвенно судить о том на сколько близко я приблизился к заданной смеси.
Проблема небольшая только в том, что гидролизат высушить у меня пока не получилось. Он не фильтруется ни через что. Попробую отобрать аликвоту, но насколько она будет адекватная, с учетом того что это суспензия, не знаю. По идее на следующей неделе привезут лаболаторную распылительную сушилку.....вот тогда можно будет поиграться)))

[avor]

А зачем сушить гидролизат? Зачем его фильтровать перед сушкой? В принципе гидролизат можно высушить на роторнике или в вакуумной центрифуге. Отфильтровать тоже можно - существуют микро и ультрафильтры, центрифуги и сепараторы.

[chemist]

Есть вещество в чистом виде, которое нужно получить. И теоретически по кривым титрования можно будет косвенно судить о том на сколько близко я приблизился к заданной смеси.

И какие параметры кривой будете принимать во внимание? Общий вид её морды, понравилась/не понравилась? . Поверьте, кофейная гуща гораздо интереснее
Если вещество индивидуальное и имеет температуру плавления, то делается проба на депрессию, вероятность ошибки ничтожна.

[avor]

К сожалению чует мое сердце, что вещество далеко не индивидуально, а дикая и к тому же слабо охарактеризованная смесь олигомеров с Мв от 110 до 10000 Да. Кстати полезно использовать, как умягчающую добавку в шампуни.

[Arrenius]

Конечно ни о какой индивидуальности речи идти не может. Там какая то жутчайшая смесь! В общем оттитровал! На удивление получил огромнейший скачок от рН 2,2 и заканчивая 12.0. Судя по всему в этом скачке включены и скачок кислоты соляной и аминогруппы. В общем титрование ни о чем похоже(((

[avor]

Вы что гидролизуете ферментом в солянокислой среде? Или грохнули туда солянки по совету трехголового.

[Arrenius]

Солянки фиганул)) И получился один большой скачек. Вот теперь сижу и думаю......почему то щелочи пошло немного больше, чем нужно для нейтрализации всей солянки что я фиганул. Это просто ошибка?

Давайте представим простой пример. Беру навеску пептидов, добавляю туда 10мл 0,1н солянки часть которой расходуется на солеобразование с аминогруппами, хочу оттитровать смесь 0,1н щелочью, но все группы титруются одновременно. В таком случае должно пойти ровно 10мл щелочи или немного больше? Может немного больше из за карбоксильных групп?

[chemist]

Чем фиксируете точку эквивалентности? Точнее индикатора это делает рН-метр.
Оттитруйте свою солянку щёлочью (глухой опыт) и РАСЧЁТНО сравните результаты.

[Arrenius]

Да я по рН метру кривую строю, в ручную, компу не доверяю)))) Т.е. из моего предыдущего примера щелочи должно пойти ровно столько же как и солянки или чуть больше? Я сейчас чисто про теорию.

[chemist]

При одинаковой нормальности объёмы кислоты и щёлочи должны быть одинаковыми по теории.

[Arrenius]

Да это понятно! Я спрашиваю карбоксильные группы пептидов должны вносить дополнительную "трату" щелочи при обратном титровании?