Помогите определить содержание белка по Бредфорду
Помогите определить содержание белка по Бредфорду
Уважаемые коллеги! Помогите разобраться! Занимаюсь определением активности антиоксидантных ферментов. Их активность пересчитывается на мг белка. Белок определяю по Бредфорду. По какой формуле мне производить расчёт белка???
Заранее спасибо
Заранее спасибо
-
- Сообщения: 260
- Зарегистрирован: Пт май 08, 2009 10:40 am
Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду
Строим калибровочную кривую по стандарту и получаем требуемую формулу (уравнение типа у = а*х + в; в идеале в=о).
Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду
Спасибо! Это сделала!Получила концентрацию белка (скажем 2320) по кривой. Перевела её в мг/мл (2,232). Потом посчитала по формуле = 2.232*3 (объем буфера, в котором растирала растения) / 0,3 9масса навески, г). В итоге получила содержание белка: 22,32 мг/г сырой ткани. Правильно ли это7 или нужно ещё умножать на тот объем растит.вытяжки, которую добавляла к Бредфорду?Joni-Fantazi писал(а):Строим калибровочную кривую по стандарту и получаем требуемую формулу (уравнение типа у = а*х + в; в идеале в=о).
Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду
Для того, чтобы ответить на ваш вопрос вы должны подробненько, как на экзамене. рассказать как вы строили градуировку и как вы измеряли белок(имеется ввиду что именно вам надо измерить например: вес белка на грамм ткани(сухой, влажной и тд), на мл буфера или мл экстракта. И подробненько всю процедуру от забора материала до смешивание с реактивом Брэдфорда. А так сумбур один и непонятки.
Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду
Avor, расписываю.
Вначале готовила реактив Бредфорда (стандартная методика (Кумасси+этанол+фосфорная ксилота+бидист.вода). Затем его калибровала по БСА (0,1 альбумина растворяла в 10 мл буфера) и затем его разводила: 50мкл БСА+950 буфера, 100 мкл БСА+ 900 буфера, 150 БСА+ 850 буфера и так далее до 450 БСА + 550 буфера. Затем в обычные пробирки добавляла по 5 мл Бредфорда и к ним добавляла по 100 мкл из разведенных пробирок (которые выше рапсисала). Получились пробирки с разной силой окраски: от слобо окрашенного - до сильно окрашенного. Строила калибровочную кривую. В дальнейшем брала 0,3 г навески растений, растирала в 3 мл бфуфера, центрифугировала. Затем брала 100 мкл этой вытяжки и добавляла к ним 5 мл Бредфорда и в дальнейшем на СФ определяла концентрацию белка по калибровочной кривой.
От этого и вопрос, правильно ли расчитываю концентрацию белка = С(цифра, которую выдал СФ по кривой) * 3 / 0,3
Вначале готовила реактив Бредфорда (стандартная методика (Кумасси+этанол+фосфорная ксилота+бидист.вода). Затем его калибровала по БСА (0,1 альбумина растворяла в 10 мл буфера) и затем его разводила: 50мкл БСА+950 буфера, 100 мкл БСА+ 900 буфера, 150 БСА+ 850 буфера и так далее до 450 БСА + 550 буфера. Затем в обычные пробирки добавляла по 5 мл Бредфорда и к ним добавляла по 100 мкл из разведенных пробирок (которые выше рапсисала). Получились пробирки с разной силой окраски: от слобо окрашенного - до сильно окрашенного. Строила калибровочную кривую. В дальнейшем брала 0,3 г навески растений, растирала в 3 мл бфуфера, центрифугировала. Затем брала 100 мкл этой вытяжки и добавляла к ним 5 мл Бредфорда и в дальнейшем на СФ определяла концентрацию белка по калибровочной кривой.
От этого и вопрос, правильно ли расчитываю концентрацию белка = С(цифра, которую выдал СФ по кривой) * 3 / 0,3
Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду
--0,1 альбумина растворяла в 10 мл буфера
0,1 ЧЕГО? Килограм, грамм, милиграмм, наномоль?
--50мкл БСА+950
950 ЧЕГО литров, миллилитров, микролитров?
У вас СФ сам строил градуировку или вы график сами рисовали и по графику определяли. И что у вас на графике на осях какие величины.
Что вас интересует вес белка в ткани или вес белка в объеме экстракта, тоже не уточнили. Концентрацию своего фермента в единицах вы на ткань пересчитываете или на объем экстракта?
Ну, ведь по человечески просили КАК НА ЭКЗАМЕНЕ! За такой ответ не то что банан вкатать, вынос с экзамена с профнепригодностью можно получить.
0,1 ЧЕГО? Килограм, грамм, милиграмм, наномоль?
--50мкл БСА+950
950 ЧЕГО литров, миллилитров, микролитров?
У вас СФ сам строил градуировку или вы график сами рисовали и по графику определяли. И что у вас на графике на осях какие величины.
Что вас интересует вес белка в ткани или вес белка в объеме экстракта, тоже не уточнили. Концентрацию своего фермента в единицах вы на ткань пересчитываете или на объем экстракта?
Ну, ведь по человечески просили КАК НА ЭКЗАМЕНЕ! За такой ответ не то что банан вкатать, вынос с экзамена с профнепригодностью можно получить.
Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду
0,1 г в 10 мл буфера (ph = 7.
50 мкл БСА + 950 мкл буфера (ph=7,8)
СФ строил градуировку сам. Я прописывала концентрации от 500 - 4500, он измерял плотности растворов в кюветах и сам строил градуировку (ось y - плотности, ось X - концентрация, мкг/л)
Концентрацию фермента мне нужно пересчитать на мг белка.
50 мкл БСА + 950 мкл буфера (ph=7,8)
СФ строил градуировку сам. Я прописывала концентрации от 500 - 4500, он измерял плотности растворов в кюветах и сам строил градуировку (ось y - плотности, ось X - концентрация, мкг/л)
Концентрацию фермента мне нужно пересчитать на мг белка.
Re: Помогите определить содержание белка по Бредфорду
По формуле С(цифра, которую выдал СФ по кривой) * 3 / 0,3 вы рассчитаете количество белка в мкг, на г ткани , которое вытягивается из ткани 10х по отношению к весу объемом вашего буфера.
Кто сейчас на конференции
Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 20 гостей