protein N-chloramine assay (plasma/serum blood)

вопросы современной биологической химии, молекулярной биологии, химической энзимологии и смежных наук
biochem, molbio, chemical enzymology and related discussions for professionals
Ответить
Demiurg
Сообщения: 131
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

protein N-chloramine assay (plasma/serum blood)

Сообщение Demiurg » Чт окт 19, 2017 12:12 am

Здравствуйте уважаемые форумчане!
Прошу помочь мне разобраться в методике определения концентрации протеиновых хлораминов (N-хлораминов), которая приводится в прицепленной статье.
Я так и не уяснил следующее: какой же объём плазмы или сыворотки нужно брать для постановки теста на определение концентрации хлораминов (Measurement of chloramine concentrations). Да, там написано, что берётся 50 мкЛ. Но это - sample mixtures, т.е. плазма/сыворотка после описанных нагрузочных воздействий...
Меня же интересует оценка концентрации N-хлораминов IN VIVO, а не после IN VITRO- воздействий, индуцирующих образование этих самых хлораминов. Проще говоря, условно в "цельной" сыворотке или плазме. То ли они сначала разводятся чем-то, то ли нет...
Авторам написал, но пока что они не ответили.
Спасибо!
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 10563
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: protein N-chloramine assay (plasma/serum blood)

Сообщение avor » Чт окт 19, 2017 12:50 am

--Я так и не уяснил следующее: какой же объём плазмы или сыворотки нужно брать для постановки теста на определение концентрации
50мкл Там планшет 96 луночный и 150мкл реагента больше 100-150мкл пробы просто не взять, в лунку не влезет. Да пробу сыворотки они разводили в 10 раз.

--Меня же интересует оценка концентрации N-хлораминов IN VIVO, а не после IN VITRO- воздействий, индуцирующих образование этих самых хлораминов. Проще говоря, условно в "цельной" сыворотке или плазме.

IN VIVO в данном случае неправильное употребление термина. По русски можно сказать не обработанная сыворотка, или на иностранный манер нативная сыворотка.

В исходной сыворотке хлораминов может оказатся на несколько порядков меньше, чем в обработанной гипохлоритами и пероксидазами.

Demiurg
Сообщения: 131
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: protein N-chloramine assay (plasma/serum blood)

Сообщение Demiurg » Чт окт 19, 2017 9:32 am

Спасибо, avor!
Да-да, Вы правы меня интересует определение хлораминов именно в необработанной (нативной) сыворотке и плазме (полученных из крови "как есть").
Я знаю, что предельная ёмкость лунки 96-луночных плашек около 350 мкл (можно и 370, но у же будет через край перехлёстывать).
Сам протокол определения хлораминов, приводимый в этой статейке, у меня вопросов не вызывает (150 мкл реагента и 50 образца). Но вот что подразумевается под образцом? Авторы пишут sample mixtures. И вот что это?
Сыворотка и плазма, предварительно разведённые водой 1:10 (Human quality control samples (serum) were thawed to room temperature and centrifuged at 2500g for 5 min and diluted (1:10 for reagent HOCl oxidation) with deionized water.), т.е. в 11 раз? И уже эту разведённую сыворотку/плазму понимают под sample mixtures?
Или же они делали так ( Fifty microliters of human EDTA plasma and animal serum was added to a similar MPO oxidation system with PBS (90ml) for ex vivo experimentation (i.e., chloramine analysis).)?
Вот именно предварительное разведение сыворотки/плазмы мне неясно.

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 10563
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: protein N-chloramine assay (plasma/serum blood)

Сообщение avor » Чт окт 19, 2017 12:37 pm

Я так пологаю в 10раз разводили, но в вашем случае можно и не разводить ибо у вас априорно хлораминов будет в разы, а может и в порядки меньше я вообше не уверен, что в этой системе вы что нибудь увидите.

Demiurg
Сообщения: 131
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: protein N-chloramine assay (plasma/serum blood)

Сообщение Demiurg » Чт окт 19, 2017 3:52 pm

Благодарю Вас за участие в обсуждении!
Выкладываю результаты измерений N-хлораминов (или что там на самом деле измерилось) в сыворотке крови лаб. крыс. Ну, синяя окраска после 25 мин. инкубации была, как говорится, "на лицо", в то время как холостая проба (вода вместо сыворотки) осталась бесцветной.
Я не знаю как авторы статьи устанавливали концентрацию N-хлораминов. Возможно, по калибровке на основе какого-нибудь гипохлорита. Впрочем, если и так, то ни солей, ни самой хлорноватистой кислоты у меня нет. Поэтому я рассчитал концентрацию по формуле: С = оптич. пл./(30000*0,622).
Где 30000 - коэффициент молярной эктинкции хромогена, М-1*см-1 (по данным той самой работы, на которую идёт ссылка в описании методики определения концентрации хлораминов)
0,622 - длина оптического пути при наличии в лунке планшета 220 мкл жидкости, см (я брал не 50 и 150, а 55 мкл разведённой в 11 раз деионизированной водой сыворотки и 165 мкл реагента, но соотношения те же).
Я попробовал сделать калибровку на основе хлорамина-Т. Получается линейная зависимость оптической плотности от концентрации хлорамина-Т. Но можно ли её применить - ?
Кроме того, пик поглощения скорее находится в районе 650-655 нм (а не на 620 нм).
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

Ответить

Вернуться в «биохимия и молекулярная биология / biochemistry and molecular biology»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 3 гостя