Экстракция веществ из лишайников

[Demiurg]

Здравствуйте уважаемые участники форума!

Требуется проводить экстракцию (условно говоря всех, что в них есть) веществ из талломов лишайников. Сами талломы предварительно высушены и измельчены до порошкообразного состояния (в шаровой мельнице). Экстракцию планируется проводить различными растворителями (в частности, метанолом, гексаном, ацетоном) путём помещения определённой навески таллома лишайника и добавления к нему определённого объёма растворителя (всё это в герметичной пробирке, которая установлена на качающейся платформе). Хотелось бы прояснить следующие моменты:
1. cоотношение массы таллома и объёма растворителей.
2. время экстракции (по-крайней мере, одной порцией растворителя).
3. общая схема экстракции (однократная обработка растворителем или же обработка несколькими новыми объёмами одной и той же навески и последующее объединение этих объёмов в один общий).
Экстракты в дальнейшем планируется тестировать на содержание основных фитонутриентов (флавоноиды, полифенолы и др.), а также использовать в различных тестах на ингибирование продукции свободных радикалов и оксидантов. В теории как бы хочется добиться максимально полной экстракции из талломов основных классов содержащихся в них веществ. Экстрактора Сокслета в наличии нет...
В имеющейся литературе по этим вопросам наблюдается большое разнообразие (кто-то ограничивается 10-15 минутной экстракцией одной порцией растворителя, а кто-то экстрагирует 3 раза по 24 часа каждый раз новым объёмом...).
Спасибо!

[Joni-Fantazi]

Экстракция предполагается одним растворителем или поочерёдно разными с одной навески?
Если цель выделить, определить состав и далее тесты, то особого смысла "тянуть до последней капли", вроде как и нет, разве что определить их содержание в источнике.
Экстракцию я бы делал при соотношении 1:10 (вес:объём растворителя) по времени час и раза три-пять новой порцией растворителя.
А вообще лучше тогда сделать несколько вариантов и следить за динамикой выделения, например, сканирующим спектрофотометром по снижению основных пиков поглощения.
Ещё может оказаться, что состав экстрактов на разных ступенях экстракции одним растворителем может быть разный (т.е. на первой и третьей, например).

[Phobos]

вещества устойчивые? Это архиважный вопрос, определяющий максимально отпущенное Вам на процесс время.
Если устойчивые, то сперва начните с определения растворителя, в каком будет большая концентрация нужного вещества с одинарной промывки.
Потом три-четыре промывки подряд, с декантацией или фильтрацией. Смотрим, сколько вещества в последнем фильтрате.
Потом упарка и проверка, сколько мусора каждый растворитель вытащил вместе с веществом.
Заранее предсказать невозможно, поскольку эффективность р-рителя зависит не только от растворимости в нем самого вещества, а еще и от его умения растворять мембраны клеток и его высвобождать.
На интересующие вещества полезно прикупить стандарты, для определения концентрации в HPLC или УФ, если повезет.

[Demiurg]

Спасибо за ответы!
Экстракцию я собирался делать "по писанному" (как в публикации). Протокол там следующий:

Completely freeze-dried and ground lichen samples, 1–10 g (Table 1) were extracted in a mixture of methanol
and water (90:10 v/v). Then, the extracts were filtered and solvent was evaporated at 38 °C under vacuum. This
extraction procedure was repeated three times to ensure the complete extraction of extractable compounds. The
total extract of a specimen was dissolved in distilled water (100 mL) and washed with hexane (300 mL) three
times to remove pigments and fats. The water phase of extract was further washed with dichloromethane
(300 mL) (DCM) thrice to remove medium polar compounds. The remaining water phase was freeze-dried,
and residue dissolved in methanol. Insoluble parts of sugar and polysaccharides were removed. The DCM and
methanol fractions of the extracts were then lyophilized and stored at−20 °C until further use.

Я с авторами немного пообщался и те ответили, что экстрагировали 3 раза по 24 ч. каждый раз новой порцией растворителя, объединяли эти 3 порции и выпаривали в токе азота. А какое брали соотношение навески и объёма растворителя - не ответили))
Но это лишь один из множества весьма разнообразных используемых способов экстракции (как уже упоминал, делают кто во что горазд).
Я вот не знаю: обработать талломы сначала полярным растворителем (чтобы вытащить водорастворимые в-ва) и потом неполярным (водонерастворимые) или же обрабатывать просто разными растворителями (полярным и неполярным) один и тот же лишайник параллельно...
Стандартов нет. Да и на начальном этапе интересует определение (количественное) классов веществ (полифенолы, флавоноиды, антоцианы, хлорофиллы, каротиноиды), а не химически индивидуальных веществ. Это планируется делать позже (да, с использованием ВЭЖХ), А пока задача - получить (условно говоря) тотальные экстракты (всего, что там есть) и количественно определить основные классы соединений и посмотреть антиоксидантную/ антирадикальную и цитотоксическую активность.

[Joni-Fantazi]

Обычно сначала неполярные растворители, а потом полярные, т.к. то, что экстрагируется неполярным обычно мешает экстракции полярным. Делать последовательно или параллельно - Вам решать, т.к. составы экстрактов (только полярных, конечно) будут разные.
По соотношению растворитель/сырьё попробуйте покопать в предыдущих статьях авторов (9-11 в литературе). Для неполярных растворителей соотношение 5-10:1 будет вполне приемлемо, т.к. сырьё в них вряд ли будет набухать. А вот для воды может и 1:20 придётся брать, хотя для экстракции без нагрева скорее всего 10-15:1.
По моему мнению 24 часа это перебор, но может где-то они эти сроки обосновывают. Может просто удобно - утром поставил, утром снял и весь рабочий день с экстрактами возишься.

[Phobos]

Весьма похоже на проект, который как-то был у нас.
Еще раз - метанол нужен для растворения/развала клеточных мембран, без него просто невозможно, видимо, высвободить все вещества наружу. Не изобретайте велосипед, делайте, как написано, подход выглядит разумным - кроме сроков экстракции. Я бы сократил на 20 минут максимум для каждой экстракции, проверяя ТСХ каждого экстракта. Когда на ТСХ ничего не видно, можно всю порцию упарить и посмотреть, нет ли веществ, не видных на ТСХ.
Деление на три части по полярности выглядит разумным.
Фильтрация - видимо, подразумевается через силит. Эти клетки набухают и становятся липкими, через обычный фильтр трудно фильтровать.
Авторы ничего не говорят о стабильности - видимо, ничего не знают. Это плохо. Будьте готовы к тому, что часть веществ нестабильна на воздухе и на свету.
Богатенькие буратины часто пробуют такие субстраты на экстракцию жидким CO2 - там получаются нередко чудеса и волшебство, позволяющие селективно вытащить нужные вещества без кучи мусора впридачу.

[Любитель_Манниха]

Есть ещё такая "pressurized liquid extraction", субкритическими растворителями.

ТС, все интересующие вас вещества будут валиться на воздухе и на свету, принимайте соотв. меры(в том числе дегазацию растворителей).

Обезжиривание, кстати, можно делать и жикостно-жидкостной экстракцией, типа извлекли водным спиртом/ацетонитрилом, потом потрясли с гексаном и гексановый слой отбросили.