Биомедицинская масс-спектрометрия MALDI

[Shreyner]

Добрый день!у меня такой вопрос: для своей дипломной работы я исследую сайты ацетилирования белков крови человека и крысы (альбумин и гемоглобин) при их взаимодействии с ацетилсалициловой кислотой методами масс-спектрометрии. На данный момент мной проведена модификация этих белков и сняты масс-спектры (MALDI), найдены модифицированные пики (т.е. сранивала модифицированный и немодифицированный белок на появление новых пиков с разницей 42.01 Да), но чтобы доказать, что модификация прошла и это именно АСК нужно провести MS-MS анализ, но найденные пики малы по интенсивности и поднять их для тандемной масс-спетрометрии очень сложно. Может вы что-нибудь посоветуете, чтобы эти интенсивности повысить?
Для модификации мной были взяты различные концентрациИ АСК от 0.01-4 mM, после модификации проводился ферметативный гидролиз (трипсин), а дальше триптические гидролизаты я элюировала градиентом ацетонитрила с колонки С18.
Спасибо!

[DSP007]

Провести целевое выделение заданной фракции белков ультрацентрифугированием форменных элементов , колоночной Hilic-хроматографией , ионнообменной хроматографиией или плоскостным электрофорезезом сможете?
А по поводу непосредсвенно MALDi приглашаю вас на anchem , гдя я думаю Вас не откажется проконсультировать многоопытный в этих делах уважаемый Islander.

[Upstream]

Уверен, что ваша проблема решается без привлечения MS-MS, так как для таких исчерпывающе изученных белков последовательности (а следовательно и массы) всех триптических пептидов известны и где-то затабулированы. С высокой вероятностью будут ацетилироваться лишь N-конец и боковые аминогруппы лизинов. Причём в последнем случае будут наблюдаться продуты трипсинолиза с внутренним ацетилированным лизином -----Lys(Ac)------[Lys/Arg]. Если Вас волнуют маловероятные гипотетические продукты О-ацилирования, то их можно будет исключить по результатам кратковременного защелачивания до рН 9-10 (так же как и модификацию по гистидиновому имидазолу).

[Shreyner]

да, про то что ацелируется именно лизин мы в курсе. просто имеются данные и о возможной модификации серина.
в любом случае спасибо большое!

[avor]

Неужели трипсинолиз не отделяет одни сайты ацетилирования от других. Попробуйте другую протеазу, например химотрипсин или V8. Вообще протеаз много в софте к MALDI есть длинный список, надо подобрать такую(или такие), что бы серин и лизин оказались в разных фрагментах(кроме того есть еще и не ферментные методы специфичного гидролиза белка) и все. А я то думал у вас проблемы с доказательством того, что именно аспирин является источником ацетилирования.