Как удалить фосфат кальция из культуры клеток

[kpars]

Здравствуйте, уважаемые коллеги! Помогите пожалуйста с одной технической трудностью с экспериментом. Наша лаборатория выращивает культуры клеток, которые со временем секретируют минерализованный матрикс (фосфат кальция). Возможно ли каким-либо образом (например, с помощью слабой органической кислоты) удалить соли кальция таким образом, чтобы не повредить клетки? Или это технически невозможно сделать? К сожалению, целый университет не знает, как это можно было бы сделать, и в литературе ничего толкового не нашел. Заранее большое спасибо всем, кто откликнется! Карен

[ChemNavigator]

Может ЭДТА (Трилон Б) подойдёт? Он вымывает кальций.

[chemist]

Слабые кислоты не растворят фосфат кальция, растворяет только фосфорная и более сильные кислоты, рассуждения см.: viewtopic.php?f=10&t=96309 . Вряд ли их выдержат Ваши клетки.
Если кальций сидит прочно в клетках (например, в активных центрах ферментов), то из них его не выцарапаешь никакими комплексонами, а если вырвешь, то клеткам также не поздоровится. Если же это просто секрет, то извлечь можно, например, специфическими ионитами с ионными переносчиками. Также могут подойти кальций-специфические лиганды типа краун-эфиров или критандов. Может есть и кальций-селективные ионообменные мембраны, но я таких не видел. Кальций вообще трудно удаляется, т.к. двухвалентный и образует малорастворимые соли со многими органическими кислотами (в т.ч. аминокислотами и белками).

[kpars]

Может ЭДТА (Трилон Б) подойдёт? Он вымывает кальций.

По-моему ЕДТА уже пробовали в другой лаборатории, но к сожалению не особо успешно. Но все равно спасибо за совет!

[kpars]

Слабые кислоты не растворят фосфат кальция, растворяет только фосфорная и более сильные кислоты, рассуждения см.: viewtopic.php?f=10&t=96309 . Вряд ли их выдержат Ваши клетки.
Если кальций сидит прочно в клетках (например, в активных центрах ферментов), то из них его не выцарапаешь никакими комплексонами, а если вырвешь, то клеткам также не поздоровится. Если же это просто секрет, то извлечь можно, например, специфическими ионитами с ионными переносчиками. Также могут подойти кальций-специфические лиганды типа краун-эфиров или критандов. Может есть и кальций-селективные ионообменные мембраны, но я таких не видел. Кальций вообще трудно удаляется, т.к. двухвалентный и образует малорастворимые соли со многими органическими кислотами (в т.ч. аминокислотами и белками).

Спасибо большое за ссылку! Кальций находится не внутри клеток, а во внеклеточном пространстве, где он покрывает коллагеновые волокна, соединяющие клетки. Поэтому для того, чтобы их разъединить, необходимо сначала каким-то образом удалить кальций. Я пробовал коллагеназу П и трипсин, но они, к сожалению, не особо эффективны, если коллагеновые волокна пропитаны кальцием. В любом случае, спасибо за внимание к моей проблеме!

[зыркало1]

Спонтанный вопрос... А как будет влиять изменение рН???

[chemist]

Спонтанный вопрос... А как будет влиять изменение рН???

Понижение рН, конечно, растворит кальций, но проблема в том, чем создавать приток Н+. В любом случае, как низкий рН, так и неизбежное прибаление анионов может не понравится клеткам. Поэтому для таких случаев и используют иониты, у которых анионы зашиты в полимер и никуда не гуляют, ну а отковыривать кальций от клеток и переносить на ионит могут вещества- переносчики, в данном случае это могут быть биокислоты типа лимонной, яблочной и т.п. Главное, чтобы клетки не облюбовали поверхность ионита в качестве жилища, такое часто бывает, тогда надо ставить мембрану и качать раствор туда-сюда.

[amik]

По-моему ЕДТА уже пробовали в другой лаборатории, но к сожалению не особо успешно. Но все равно спасибо за совет!

EDTA и не могло помочь, в слабокислой и нейтральной среде она кальций не комплексует - работает только в щелочной
Теоретически из ряда комплексонов может сработать HEDP, cas 2809-21-4, она же гидроксиэтилидендифосфоновая кислота, она же этидроновая кислота(еtidronic acid). Препараты на ее основе в виде динатриевой или калий-натриевой соли применяются в медицине для регуляции кальциевого обмена в тканях.
См. российский препарат "ксидифон", как называются американские аналоги, не знаю. Ссылка на википедию Etidronate, unlike other bisphosphonates, also prevents bone calcification.

P.S. Поскольку тема непосредственно к органической химии не относится, переношу в общий раздел.

[ChemNavigator]

Слабые кислоты не растворят фосфат кальция, растворяет только фосфорная и более сильные кислоты

Более сильные кислоты нужны для того, чтобы получить фосфорную кислоту из её солей. Здесь такая задача не ставится: фосфорная кислота - трёхосновная, и второй протон менее кислый чем первый, третий - ещё менее кислый. Поэтому для того, чтобы перевести нерастворимый фосфат кальция Ca₃(PO₄)₂ в вот такой растворимый фосфат Ca(H₂PO₄)₂ достаточно будет гораздо более слабой кислоты, к которой клетки будут вполне устойчивыми.
Если кислоту добавлять медленно по каплям и при перемешивании, то каждая порция будет успевать прореагировать с фосфатом без сильного изменения pH, и клетки вполне могут это выдержать.

[avor]

ЭЭЭ! А можно узнать что за клетки, из какого организма с какой клеточной стенкой и тд. Каков состав среды для культивирования. И коллаген аппатитный комплекс он какой толщины, клетки на поверхности этого комплекса или в толще пористой структуры находятся и в какой посуде это все происходит.

[chemist]

Если кислоту добавлять медленно по каплям и при перемешивании, то каждая порция будет успевать прореагировать с фосфатом без сильного изменения pH, и клетки вполне могут это выдержать.

С организмами всё сложнее, часто даже многократный избыток реагента не вышибает металл. Надо ведь преодолеть клеточную мембрану, а это можно сделать или нежно (с отмычкой), или проломом, но тогда им капут

[kpars]

По-моему ЕДТА уже пробовали в другой лаборатории, но к сожалению не особо успешно. Но все равно спасибо за совет!

EDTA и не могло помочь, в слабокислой и нейтральной среде она кальций не комплексует - работает только в щелочной
Теоретически из ряда комплексонов может сработать HEDP, cas 2809-21-4, она же гидроксиэтилидендифосфоновая кислота, она же этидроновая кислота(еtidronic acid). Препараты на ее основе в виде динатриевой или калий-натриевой соли применяются в медицине для регуляции кальциевого обмена в тканях.
См. российский препарат "ксидифон", как называются американские аналоги, не знаю. Ссылка на википедию Etidronate, unlike other bisphosphonates, also prevents bone calcification.

P.S. Поскольку тема непосредственно к органической химии не относится, переношу в общий раздел.

Спасибо!

[kpars]

Слабые кислоты не растворят фосфат кальция, растворяет только фосфорная и более сильные кислоты

Более сильные кислоты нужны для того, чтобы получить фосфорную кислоту из её солей. Здесь такая задача не ставится: фосфорная кислота - трёхосновная, и второй протон менее кислый чем первый, третий - ещё менее кислый. Поэтому для того, чтобы перевести нерастворимый фосфат кальция Ca₃(PO₄)₂ в вот такой растворимый фосфат Ca(H₂PO₄)₂ достаточно будет гораздо более слабой кислоты, к которой клетки будут вполне устойчивыми.
Если кислоту добавлять медленно по каплям и при перемешивании, то каждая порция будет успевать прореагировать с фосфатом без сильного изменения pH, и клетки вполне могут это выдержать.

Спасибо большое за совет! В приципе, я тоже хотел бы так сделать, просто мой научный руководитель раскритиковал эту идею. Она считает, что любая кислота неизбежно приведет к гибели клеток. Мы, к сожалению, не химики и нам намного труднее судить, чем вам

[kpars]

ЭЭЭ! А можно узнать что за клетки, из какого организма с какой клеточной стенкой и тд. Каков состав среды для культивирования. И коллаген аппатитный комплекс он какой толщины, клетки на поверхности этого комплекса или в толще пористой структуры находятся и в какой посуде это все происходит.

Это клетки из пульпы зубов 5-7 дневных мышат. В принципе, это в основном обычные фибробласты с небольшим количеством клеток других типов, в том числе и предшественников клеток, которые формируют костную ткань и дентин, тведрая минерализованная ткань зубов. Поэтому когда эти клетки растут в культуре, они синтезируют очень много коллагена, основной компонент этих тканей, после чего он минерализуется, то есть как бы пропитывается солями кальция, в основном - фосфат. Среда культивирования это либо DMEM/сыворотка для роста клеток, либо MEM alpha/сыворотка, аскорбиновая кислота и 2-глицеролфосфат, как источник неоганического фосфата. Сложно сказать, какой толщины этот комплекс, мы не определяли это. Сам комплекс находится между и на поверхности клеток. Посуда обычная для культивирования клеток http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct ... ber=353043
Спасибо!

[ChemNavigator]

Насчёт растворимости каркаса в кислотах - проще проверить это экспериментально. Начните, например, с уксусной и лимонной кислот - будет видно растворяют они каркас или нет. Судя по данным pK, эти кислоты сильнее чем 2-я и 3-я ступень фосфорной кислоты.

[Любитель_Манниха]

kpars, интересно А зачем Вам удалять фосфат, но сохранять клетки? Подразумевается, что после этого они будут как-то по-другому работать?

[Smol]

А вот я слышал, что употребление дистилированной воды вымывает кальций из костной ткани. И происходит это довольно быстро...

Кстати, когда-то был такой случай: каких-то там моллюсков посадили на диету без кальция (чтобы посмотреть, из чего они себе панцыри растить будут), так они, гады, все равно панцыри вырастили. Причем из солей кальция. Стали разбираться - так ничего и не поняли, но предположили, что моллюски научились калий в кальций трансмутировать...

[Archeolog]

Здравствуйте, уважаемые коллеги! Помогите пожалуйста с одной технической трудностью с экспериментом. Наша лаборатория выращивает культуры клеток, которые со временем секретируют минерализованный матрикс (фосфат кальция). Возможно ли каким-либо образом (например, с помощью слабой органической кислоты) удалить соли кальция таким образом, чтобы не повредить клетки? ...

Можно борной кислотой попробовать.

[Любитель_Манниха]

А вот я слышал, что употребление дистилированной воды вымывает кальций из костной ткани. И происходит это довольно быстро...

А культура клеток не сдохнет, если её дистиллятом промывать? Вымываться-то будет всё, осмос аднака.

[kpars]

Насчёт растворимости каркаса в кислотах - проще проверить это экспериментально. Начните, например, с уксусной и лимонной кислот - будет видно растворяют они каркас или нет. Судя по данным pK, эти кислоты сильнее чем 2-я и 3-я ступень фосфорной кислоты.

Так и сделаю, спасибо! Как раз на днях надо будет заканчивать эксперимент, на нем и буду пробовать Я думаю попробовать уксусную кислоту, чтобы растворить кальций, и потом коллагеназу, чтобы разрушить коллаген. Обязательно сообщу, какие результаты мы получим!