Ацилирование N-гидроксисукцинимидными эфирами

[Semithin]

У меня персистирующая проблема с ацилированием тирамина несколькими коммерческими NHS эфирами флуоресцентных красителей. В то время как с NHS-эфиром флуоресцеина, тетраметилродамина получаются ожидаемые соединения, NHS-эфир Alexa Fluor-568 (прикрепляю формулу) активного соединения не дает. В чем может быть подвох? Чисто теоретически? Уж простите , успешность реакции проверяется по последующей реакции амида тирамина с пероксидазой. Аналогичная реакция с NHS-эфиром Alexa Fluor-488 в тех же условиях проходит на ура (тоже прикрепляю схему)

По статьям, стандартными условиями является инкубация реагентов в DMSO при комнатной температуре.
Понимаю, что мне бы сделать нормальную аналитику - MS или ЯМР, но я работаю с миллиграмовыми количествами, поэтому на анализ просто нечего отдавать. Просьба ссаными тряпками не закидывать )

[Jokermaniak]

На MS достаточно несколько микрограммов, с ним в другом проблема. А у вас исходный NHS-эфир живой? Я не раз сталкивался с тем, что даже за многоденяк из всяких сигм и сантакрузов приходили дохлые активированные эфиры.

[sidhar]

Можно начать с ТСХ. И исходник проверите, как коллега советует. И попробуйте получить ТСХ-стандарт Alexa Fluor-568-COOH в эпп с водой.

[Nickolas]

Угу, такие эфиры дохнут от следов влаги. Попробуйте в реакцию добавить пару экв. EDC или другого карбодиимида. Но нужно следить за ходом реакции по HPLC-MS.

[Semithin]

Спасибо всем кто ответил! В следующий раз буду проводить реакцию в присутствии EDC. Подскажите, одного эквивалента должно быть достаточно?
Jokermaniak Вы написали,

На MS достаточно несколько микрограммов, с ним в другом проблема.

а в чем тогда сложность с использованием MS? Или речь шла о проблеме с активированным эфиром?

[Nickolas]

В следующий раз буду проводить реакцию в присутствии EDC. Подскажите, одного эквивалента должно быть достаточно?

Я бы взял ваш не работающий реагент, растворил сперва в небольшом количестве сухого растворителя (ДМФ или ДМСО), добавил 2 экв EDC и оставил стоять пару часов без доступа воздуха. Потом бы использовал его как обычный раствор OSu эфира.

[Semithin]

А еще скажите, ДМСО достаточно для данной цели посушить гидроксидом калия или потребуется более серьезный осушитель типа гидрида кальция?

[Cherep]

Окромя разделов в "Оргикумах, ПОХах, Титце-Айхерах, Вогелях" и прочих источниках, есть сведения из первичной литературы об осушке растворителей
https://www.chemport.ru/forum/viewtopic ... 142#p69142

[Jokermaniak]

Я чет забыл как удалять дубли.

[Jokermaniak]

А еще скажите, ДМСО достаточно для данной цели посушить гидроксидом калия или потребуется более серьезный осушитель типа гидрида кальция?

У меня есть обоснованные сомнения в способности коня сколько-нибудь заметно сушить ДМСО, особенно учитывая, что он в нем растворяется. Чтобы именно посушить ДМСО, т.е. убрать воду, отлично подходят молсита 4А. Я обычно, если ДМСО не сильно пахучий, ситами засыпаю и юзаю. Если нет сит, можете с CaH2 перегнать в вакууме.

а в чем тогда сложность с использованием MS? Или речь шла о проблеме с активированным эфиром?

Сложность в том, что он не количественный. Предположим, вы вкололи, и увидели там пики исходника и продукта гидролиза равной интенсивности. Но это не значит, что в смеси они 1:1, соотношение в смеси может отличаться от соотношения пиков на порядки. А ещё там могут быть другие примеси, которые не полетели.