Реакция EDC HCl и NHS друг с другом в воде без присутствия карбоновой кислоты

[Мириада]

Здравствуйте, коллеги!

Столкнулась с интересным наблюдением и хотела бы узнать ваше мнение.

При смешивании EDC·HCl и NHS в небольшом количестве воды (без добавления карбоновой кислоты) и при высоких концентрациях реагентов происходит быстрое выделение газа (пузырьки) и заметный нагрев раствора.

Вопросы:

Могут ли EDC и NHS реагировать друг с другом напрямую в воде в отсутствие карбоновой кислоты, какие аддукты, реакционные интермедиаты они могут давать, которые впоследствии могут модифицировать амины?

Что может быть источником газовыделения - возможно ли разложение EDC или его аддуктов с NHS с выделением CO₂, N₂, или какого-либо другого газа?

Какие побочные реакции могут происходить в такой системе и приводить к тепловому эффекту?

Любые статьи, механизмы или практический опыт будут очень полезны. Спасибо!

[Cherep]

что-то известно

[Мириада]

Интересно! Спасибо большое!
Я еще думала, что нагрев может быть связан с экзотермическим гидролизом EDC, а пузырьки - это, вероятно, CO2 из воды. pH нашей Milli-Q воды около 7.5–8, возможно из-за растворённого бикарбоната. При добавлении NHS pH понижается, что может способствовать выделению CO₂.
Единственное, что меня смущало, это что пузыри появлялись только после добавления NHS.

Имеет ли это смысл?

[Cherep]

если электропроводность вашей Milli-Q воды соответвует норме, откуда там столько гидрокарбоната?

[Мириада]

На самом деле, я смешивала EDC и NHS в воде, чтобы проверить свою гипотезу, и теперь, когда Вы показали статью, мне кажется, что я действительно на верном пути.

Дело в том, что EDC и NHS использовались для конъюгации инсулина к наночастицам, покрытым 3-меркаптопропионовой кислотой. Протокол был разработан не мной, и у меня есть немало вопросов к самой процедуре, но моя задача заключалась в масштабировании процесса.

Процедура достаточно простая. К небольшой аликвоте раствора наночастиц добавляется EDC·HCl и NHS, затем смесь дополнительно разбавляется водой (именно здесь, как мне кажется, и начинается быстрая реакция между EDC и NHS). Раствор перемешивается в течение часа при 4 °C для активации карбоксильных групп. Затем добавляется карбонатно-бикарбонатный буфер, и pH раствора поднимается до 10 (я предполагаю, что на этом этапе NHS-эфиры уже начинают разрушаться). После этого вводится инсулин, растворённый в воде с добавлением 0.1 M HCl, и реакционная масса перемешивается ещё 4 часа. Далее проводится очистка методом диализа.

Мне удалось показать, что эффективность конъюгации в таком процессе крайне низкая — её практически нет. Однако что интересно: HPLC-анализ стабильно показывает три пика — чистый инсулин и две его модифицированные формы (побочные продукты). Причём образование этих побочных форм происходит селективно (одна примесь составляет 35%, вторая 10%). Я предположила, что обе модификации обусловлены действием EDC и NHS. И действительно, если исключить эти два реагента из протокола, побочные фракции исчезают полностью.

MS-анализ показывает, что одна из примесей (та, что составляет 35%) — это инсулин с присоединённой пропионильной группой по глицину (B23). Второй вариант - карбометилирование того же глицина (В23). Обе модификации дают прирост массы на 56–57 Da.

Я пришла к выводу, что именно продукты взаимодействия EDC и NHS модифицируют инсулин. Механизм, который Вы показали, вполне вписывается в эту теорию. Хотя остаётся не до конца понятным, как именно могли образоваться группы CH₃CH₂CO– и NH₂COCH₂– — я так понимаю, тут наблюдается ацилирование инсулина почему-то именно по аминогруппе глицина (В23).

Буду очень признательна, если Вы поделитесь своими мыслями на этот счёт.

[Cherep]

MS-анализ показывает, что одна из примесей (та, что составляет 35%) — это инсулин с присоединённой пропионильной группой по глицину (B23). Второй вариант - карбометилирование того же глицина (В23). Обе модификации дают прирост массы на 56–57 Da.

что-то мне пока это кажется невероятным

Как были получены эти данные?

[Мириада]

Побочные продукты были выделены, очищены, разрушены на более мелкие пептиды с помощью трипсина и проанализированы методом масс-спектрометрии. Сравнение полученных результатов с базой данных дало вышеупомянутые результаты.

На самом деле, учитывая, что эффективность конъюгации в этих условиях практически нулевая, самым простым решением может быть снижение загрузок EDC и NHS (в настоящее время соотношение инсулин:EDC:NHS составляет 1:25:46).
В целом наблюдаются следующие закономерности:

- При полном исключении EDC и NHS продукт становится чистым: на HPLC-UV наблюдается только один пик инсулина, обе примеси полностью исчезают.

- При снижении загрузки EDC и NHS в 2 раза концентрация чистого инсулина увеличивается на 50%, концентрация первого побочного продукта снижается на 50%, а второго — на 38%.

- Добавление EDC и NHS в заранее охлаждённую до 4 °C воду для активации карбоксильных групп увеличивает концентрацию чистого инсулина на 5%, и также увеличивает концентрацию основного побочного продукта — на 10%.

- После активации карбоксильных групп на наночастицах рН раствора доводится до 10, затем добавляется раствор инсулина. Если инсулин добавлять быстрее, чем обычно, его содержание в конечном продукте увеличивается, а концентрация примесей снижается (эффект боле быстрого разбавления?).

- Если в воду сначала добавляется NHS, а затем EDC, концентрация чистого инсулина в продукте увеличивается на 35%, а концентрация основного побочного продукта снижается на 17%, а второго побочного продутка - на 26% даже без уменьшения загрузок NHS и EDC.

- При снижении pH с 10 до 8.5 концентрация инсулина увеличивается примерно на 12%, но основная примесь возрастает на 30%.

Я думаю, что контрольные эксперименты только с EDC и только с NHS могут помочь сузить круг поиска, хотя, скорее всего, именно их комбинация приводит к модификациям пептида.

[Nickolas]

Для начала я бы попробовал понять, есть ли на ваших наночастицах меркаптопропионовая кислота и сколько ее. Вы сами их готовили? Каким образом они реагируют с меркаптопропионовой кислотой? Сколько там активных карбоксильных групп на грамм наночастиц? Каким образом это можно подтвердить?

[Nickolas]

Я пришла к выводу, что именно продукты взаимодействия EDC и NHS модифицируют инсулин. Механизм, который Вы показали, вполне вписывается в эту теорию. Хотя остаётся не до конца понятным, как именно могли образоваться группы CH₃CH₂CO– и NH₂COCH₂– — я так понимаю, тут наблюдается ацилирование инсулина почему-то именно по аминогруппе глицина (В23).

Если у вас глицин не N-терминальный, то вряд ли он может вступать в реакцию. Если даже предположить, что реакция идет по амидо-группе, то в протеине полно остатков аспарагина и глутамина, с которыми подобная реакция была бы более вероятной, так как это первичные амиды.
Я бы еще раз проверил данные, полученные с помощью трипсина и масс-спектрометрии, так как вряд ли это глицин..

А что еще у вас есть в растворе? Какой буфер?

[Мириада]

Для начала я бы попробовал понять, есть ли на ваших наночастицах меркаптопропионовая кислота и сколько ее. Вы сами их готовили? Каким образом они реагируют с меркаптопропионовой кислотой? Сколько там активных карбоксильных групп на грамм наночастиц? Каким образом это можно подтвердить?

Контрольный эксперимент, когда у нас все то же самое, но наночастицы, покрытые 3-меркаптопропионовой кислотой, не добавляются - дает абсолютно тот же результат, что и с ними, что без них - то же самое количество инсулина и и то же самое количество этих двух загадочных примесей. (методика разработана не мной) - я ее воспроизвожу и масштабирую и хочу понять, как и почему EDC или NHS модифицируют инсулин - SDS PAGE, HPLC UV, контрольные эксперименты, ЯМР , SEM показывают, что эффективность конъюгации очень низкая, либо ее вообще нет. Я склюняюсь к механизму пассивной конъюгации
https://www.nature.com/articles/s41565-023-01565-2 - вот реакции, которые я провожу

Примеси обусловлены исключительно присутствием NHS и EDC, исключаем их и оба побочных продукта просто исчезают

[Мириада]

Я пришла к выводу, что именно продукты взаимодействия EDC и NHS модифицируют инсулин. Механизм, который Вы показали, вполне вписывается в эту теорию. Хотя остаётся не до конца понятным, как именно могли образоваться группы CH₃CH₂CO– и NH₂COCH₂– — я так понимаю, тут наблюдается ацилирование инсулина почему-то именно по аминогруппе глицина (В23).

Если у вас глицин не N-терминальный, то вряд ли он может вступать в реакцию. Если даже предположить, что реакция идет по амидо-группе, то в протеине полно остатков аспарагина и глутамина, с которыми подобная реакция была бы более вероятной, так как это первичные амиды.
Я бы еще раз проверил данные, полученные с помощью трипсина и масс-спектрометрии, так как вряд ли это глицин..

А что еще у вас есть в растворе? Какой буфер?

Карбонатный-бикарбонатный буфер (pH раствора 10) - добавляется перед добавлением раствора инсулина - мне кажется сформированные NHS-эфиры просто гидролизуются при таком pH - но методика не моя, я не могу ее кардинально менять

[Мириада]

Буду перепроверять данные масс-спектрометрии - согласна, странные модификации получаются.

[Cherep]

Побочные продукты были выделены, очищены, разрушены на более мелкие пептиды с помощью трипсина и проанализированы методом масс-спектрометрии. Сравнение полученных результатов с базой данных дало вышеупомянутые результаты.

Просто ремарка: тут наши местные масс-спектрометристы поручили стажёру установить последовательность короткого пептида с модификацией в боковой цепи триптофана. Чёто им софтина такой ереси навыдовала.... Чёрт его знает, может перепроверить вручную чтоли? Эти программы рассчитаны на "обычные" белки с природными пост-трансляционными модификациями.

На самом деле, учитывая, что эффективность конъюгации в этих условиях практически нулевая, самым простым решением может быть снижение загрузок EDC и NHS (в настоящее время соотношение инсулин:EDC:NHS составляет 1:25:46).

Ну либо после (вероятной) конверсии карбоксильных групп в окси-сукцинимидные эфиры ввести стадию диализа какого, чтобы отделить избыток "мелочёвки" (EDC и NHS и вероятные продукты их взаимодействия) от наночастиц перед добавлением инсулина?

[Jokermaniak]

Эта процедура конъюгации - какой-то треш, угар и содомия. Не очень понятно, что и зачем там масштабировать, её бы для начала до адекватного состояния довести. Судя по всему, у вас избыток реагентов сшивает весь инсулин в некий недетектируемый шит, и всего делов. Cherep дело говорит - перед добавлением инсулина надо отбиваться от избытка реагентов. А лучше вообще переходить на какой-нибудь HATU, хотя биологи его не любят почему-то.

Nickolas тоже дело говорит - ваши наночастицы с меркаптопропионовой кислотой точно те, чем кажутся? Какая там плотность карбоксильных групп, доступных для конъюгации, и отлична ли она вообще от нуля, вы проверяли?

HPLC-анализ стабильно показывает три пика — чистый инсулин и две его модифицированные формы (побочные продукты). Причём образование этих побочных форм происходит селективно (одна примесь составляет 35%, вторая 10%).

Уж сколько раз твердили миру...что ни HPLC с фотометрическим детектором, не масс-спектрометрия, без калибровки не являются количественными методами анализа. То, что у вас интеграл пика примеси на хроматограмме составляет 35% суммарного, вообще никак не означает, что у вас этой примеси 35%.

И действительно, если исключить эти два реагента из протокола, побочные фракции исчезают полностью.

Тащемта напрашивается исключать реагенты по одному. Провести эксперименты с EDC без NHS, и с NHS без EDC.

Побочные продукты были выделены, очищены, разрушены на более мелкие пептиды с помощью трипсина и проанализированы методом масс-спектрометрии. Сравнение полученных результатов с базой данных дало вышеупомянутые результаты.

Я бы не стал по данным LRMS и сравнения с базой делать столь далеко идущие выводы.

[Мириада]

Эта процедура конъюгации - какой-то треш, угар и содомия. Не очень понятно, что и зачем там масштабировать, её бы для начала до адекватного состояния довести. Судя по всему, у вас избыток реагентов сшивает весь инсулин в некий недетектируемый шит, и всего делов. Cherep дело говорит - перед добавлением инсулина надо отбиваться от избытка реагентов. А лучше вообще переходить на какой-нибудь HATU, хотя биологи его не любят почему-то.

Nickolas тоже дело говорит - ваши наночастицы с меркаптопропионовой кислотой точно те, чем кажутся? Какая там плотность карбоксильных групп, доступных для конъюгации, и отлична ли она вообще от нуля, вы проверяли?

HPLC-анализ стабильно показывает три пика — чистый инсулин и две его модифицированные формы (побочные продукты). Причём образование этих побочных форм происходит селективно (одна примесь составляет 35%, вторая 10%).

Уж сколько раз твердили миру...что ни HPLC с фотометрическим детектором, не масс-спектрометрия, без калибровки не являются количественными методами анализа. То, что у вас интеграл пика примеси на хроматограмме составляет 35% суммарного, вообще никак не означает, что у вас этой примеси 35%.

И действительно, если исключить эти два реагента из протокола, побочные фракции исчезают полностью.

Тащемта напрашивается исключать реагенты по одному. Провести эксперименты с EDC без NHS, и с NHS без EDC.

Побочные продукты были выделены, очищены, разрушены на более мелкие пептиды с помощью трипсина и проанализированы методом масс-спектрометрии. Сравнение полученных результатов с базой данных дало вышеупомянутые результаты.

Я бы не стал по данным LRMS и сравнения с базой делать столь далеко идущие выводы.

Да, контрольные эксперименты подтвердили, что обе инсулиновые примеси появляются именно из-за EDC·HCl. В присутствии только NHS на HPLC-хроматограмме наблюдается только пик инсулина.

Кстати, если из системы убрать Ag₂S-квантовые точки, покрытые 3-меркаптопропионовой кислотой, то HPLC-хроматограмма идентична той, что получается у продукта, полученного с наночастицами: концентрация инсулина с MPA-QD — 34,10 мкг/мл, а без них — 35,94 мкг/мл. Думаю, при такой процедуре конъюгация не работает, зато EDC селективно модифицирует инсулин! Я уменьшила количество EDC и NHS по отношению к инсулину, чтобы снизить количество этих двух побочных продуктов, и наночастицы начали агрегировать. Как будто инсулин не конъюгируется, но EDC и NHS всё равно влияют на поверхность и стабильность квантовых точек.

[Nickolas]

зато EDC селективно модифицирует инсулин!

Ну да, у инсулина тоже наверное остатки аспарагиновой и глутаминовой кислоты есть, которые с ним реагируют.
Не знаю, есть ли у вашего инсулина цистеин со свободной меркапто группой, с ней карбодиимиды тоже реагируют.

Кстати, избыток EDC обычно гасят меркаптоэтанолом.
Вот почитайте методику с сайта Thermofisher:
https://assets.thermofisher.com/TFS-Ass ... EDC_UG.pdf

[Cherep]

Ну да, у инсулина тоже наверное остатки аспарагиновой и глутаминовой кислоты есть, которые с ним реагируют.

4 глутаминовых и два С-конца