методика выделения аминокислоты на катионите

[andrex]

В растворе (500 мл) примерно 6 г L-аминокислоты (26 ммоль)

acid.png

+ ацетилированный D-изомер, ~2 г NaOH, ~1 г NaCl, ~3 г AcONa.
Доводим pH до ~6 и пропускаем через катионит КУ-2-8 (1,8 meq/ml)...
Вопрос:
- сколько примерно брать катионита (мл)
- с какой скоростью пропускать через колонку
- с какой скоростью отмывать водой от анионов
- с какой скоростью снимать аминокислоту 5% NH3?
Поделитесь опытом или ссылками..
Заранее благодарен!!!

[SkydiVAR]

В растворе (500 мл) примерно 6 г L-аминокислоты (26 ммоль) + ацетилированный D-изомер, ~2 г NaOH, ~1 г NaCl, ~3 г AcONa.
Доводим pH до ~6 и пропускаем через катионит КУ-2-8 (1,8 meq/ml)...
Вопрос:
- сколько примерно брать катионита (мл)

У меня была полулитровая колонка с Dowex 50WX2 - выделял до 10 г легко, думаю и 20 пошло бы...

- с какой скоростью пропускать через колонку
- с какой скоростью отмывать водой от анионов
- с какой скоростью снимать аминокислоту 5% NH3?
Поделитесь опытом или ссылками..
Заранее благодарен!!!

Скорость течения определяется только проницаемостью колонки. У меня шло самотеком, не давил и не тормозил. Отмывать от анионов деионизированной водой до рН 7. Основная масса аминокислоты выходит с фронтом р-ра аммиака (первые 200 мл), хвост тянется до литра, но там меньше 5% от первой порции.
Успехов!

[andrex]

SkydiVAR, спасибо
P.S. Вот дорос до катионита и, честно говоря, надеялся на Ваш совет, так как тема уже поднималась ранее..

[avor]

~2 г NaOH, ~1 г NaCl, ~3 г AcONa.
Натрий может мешать связыванию

--Доводим pH до ~6

Ну, я не знаю, но на мой взгляд большинство такой кислоты при таком рН, будет в нейтральной или цвитерионной форме. Я бы брал рН около 2.
Если конечно у вас кислота и Д-изомер в таких условиях не повалятся.

-- с какой скоростью пропускать через колонку
Ну кислота маленькая порядка 230 а.е.м., так что можно довольно быстро, должно хватать 5-10 минут.
--- с какой скоростью отмывать водой от анионов
Это быстро.

-- с какой скоростью снимать аминокислоту 5% NH3?
С той же что и наносили, можно быстрее, но тогда возможно большее разбавление.

-примерно 6 г L-аминокислоты (26 ммоль)
Ну, вот, в принципе, 20мл(36 мэк) смолы должно хватить. Больше 40мл думаю брать нет смысла, сильно разбавится.

На смывку приобъеме 40 уйдет не более 100мл. За концентрацией во фракциях легко следить по поглощению в УФ порядка 280-300нм.

[Upstream]

Я бы поступил проще.
1. добавил бы серной кислоты в количестве, необходимом для нейтрализации и перевода ацетата в сульфат и упарил бы с достаточным количеством воды ДОСУХА (для удаления уксусной к-ты по максимуму).
2. сухой остаток растворяем в воде, доводим рН до 6 и вновь упариваем досуха.
3. извлекаем аминокислоту горячим бутанолом и упариваем до начала кристаллизации. Как это ни странно, хлорид натрия в заметных количествах растворяется в бутаноле, насыщенном водой. Поэтому сухой остаток имеет смысл высушить хорошо, даже в эксикаторе.

[SkydiVAR]

Я бы поступил проще.
1. добавил бы серной кислоты в количестве, необходимом для нейтрализации и перевода ацетата в сульфат и упарил бы с достаточным количеством воды ДОСУХА (для удаления уксусной к-ты по максимуму).
2. сухой остаток растворяем в воде, доводим рН до 6 и вновь упариваем досуха.
3. извлекаем аминокислоту горячим бутанолом и упариваем до начала кристаллизации. Как это ни странно, хлорид натрия в заметных количествах растворяется в бутаноле, насыщенном водой. Поэтому сухой остаток имеет смысл высушить хорошо, даже в эксикаторе.

Задача стоит не просто отделить аминокислоту от неорганики, но и отделить свободную L-кислоту от N-ацетил-D-кислоты.

В растворе (500 мл) примерно 6 г L-аминокислоты (26 ммоль) + ацетилированный D-изомер, ~2 г NaOH, ~1 г NaCl, ~3 г AcONa.

Не уверен, что ацетил не слетит при упаривании с сернягой... Да еще и досуха... Впрочем - не пробовал, не знаю.

[SkydiVAR]

~2 г NaOH, ~1 г NaCl, ~3 г AcONa.
Натрий может мешать связыванию

Он и будет мешать непременно. Поэтому катионита надо взять в количестве, достаточном для связывания всех катионов.

--Доводим pH до ~6

Ну, я не знаю, но на мой взгляд большинство такой кислоты при таком рН, будет в нейтральной или цвитерионной форме. Я бы брал рН около 2.

Не знаю, не пробовал сажать амнокислоты на катионит из кислых растворов. Может и не сесть ведь, уйдет с раствором. А при рН 6 - точно сядет.

-примерно 6 г L-аминокислоты (26 ммоль)
Ну, вот, в принципе, 20мл(36 мэк) смолы должно хватить. Больше 40мл думаю брать нет смысла, сильно разбавится.

Плюс 50 мэк Na⁺ из NaOH, 30 мэк Na⁺ из NaCl и 30 мэк Na⁺ из NaOAc... И это по минимуму... А не плохо бы еще двойной-тройной избыток смолы, чтобы избежать проскока.

На смывку приобъеме 40 уйдет не более 100мл. За концентрацией во фракциях легко следить по поглощению в УФ порядка 280-300нм.

Можно и по УФ, если есть подходящий детектор. Я работал не с ароматическими кислотами, поэтому определял их по старинке - с нингидрином (капля раствора на фильтровалку, высушить феном до полного удаления аммиака, каплю р-ра нингидрина на это же место, нагреть до появления сиреневой окраски при наличии аминокислоты или почернения, если аминокилоты уже/еще нет).

[andrex]

Разделил на катионите, всё нормально, но вместо того чтобы упарить досуха (признаю, ступил ), нейтрализовал аммиак до pH~6, думал аминокислота выпадет при pI... не выпала как теперь отмываться от NH4Cl??? Поможет ли упаривание до насыщяющей концентрации NH4Cl или NaClом донасытить

[SkydiVAR]

Разделил на катионите, всё нормально, но вместо того чтобы упарить досуха (признаю, ступил ), нейтрализовал аммиак до pH~6, думал аминокислота выпадет при pI... не выпала как теперь отмываться от NH4Cl??? Поможет ли упаривание до насыщяющей концентрации NH4Cl или NaClом донасытить

Да уж, и в самом деле - ступил... Отмываться - никак. Упарить и снова на катионит.
Ну, по крайней мере я поступил бы именно так и не стал бы развлекаться с отмывкой бутанолом и прочими весьма интересными и экзотичными способами отмыть аминокислоту от NH₄Cl.

[andrex]

SkydiVAR, спасибо... буду пробовать... теперь без самодеятельности

[toxic1978]

а где можно почитать про этот самый КУ?

[SkydiVAR]

а где можно почитать про этот самый КУ?

Гуглить не пробовали?

[toxic1978]

пробовал, если по русски выдает офф. сайт но там про ее прямое применение в промышленности - очистка стоков. Меня же интересует именно ее применение в выделении аминокислот и белков.... Может подскажете?

[Upstream]

катионит КУ-2-8 это российский аналог DOWEX 50X8 ==>
==> Google: +"DOWEX 50X8" +"isolation of amino acids"
или шире: +"DOWEX 50X8" +"amino acids" ==> щастие

[Lyol'ka]

Поскольку в этой теме обсуждается и уже полюбившийся DOWEX и аминокислоты, хочу в свою очередь обратиться за консультацией и помощью.

Использую DOWEX 1x4 исходно в форме хлорида. Необходимо перевести его в ацетатную форму. Для этого:
1) отмывала смолу сначала деионозованной водой, а затем 1 М NaOH почти до бесцветного раствора (исходная смола окашивает в желто-оранжевый цвет);
2) закидывала смолу в колонку и промывала 20-ью объемами 1 М NaOH. Из колонки долгое время выходил желтоватый, пахнущий основаниями раствор;
3) затем промывала деионизованной водой;
4) если на следующем этапе если начать промывать 1М уксусной кислотой, то в колонке будут образовываться полости с воздухом, поэтому колонку вытряхивала, промывала уксусной кислотой "до изменения цвета с коричневого на золотистый", возвращала в колонку, пропускала еще примерно 2 объема кислоты и отмывала водой.

Подскажите, правильно ли подготовлена смола? сколько раз ее можно таким образом регенирировать? или может при повторном использовании будет достаточно промыть примерно 5-ью объемами 1 М уксусной кислоты?
Замечу, что на такой колонке очищаю многоосновную кислоту - аналог этилентриаминтетрауксусной кислоты. и в реакционной смеси много хлорид-ионов. При каком рН необходимо наносить вещество на колонку?

[SkydiVAR]

Я не работал с анионитами, поэтому не могу сказать, сколько раз смолу можно регенерировать. Десяток-другой раз - наверное, можно.
Для регенерации катионита (после разделения - в NH4⁺-форме) применялась следующая процедура: 1)отмывка водой до нейтральной реакции; 2)отмывка 1М солянкой - 5 объемов колонки; 3)отмывка водой до нейтральной реакции. В Н⁺-форме смола хранилась в колонке.
Если следующее разделение производилось в течение недели - дополнительная обработка смолы не производилась, в противном случае смола промывалась перед использованием сначала пятикратным объемом метанола, потом повторялся стандартный цикл регенерации.
Два десятка регенераций смола выдержала точно без потери эффективности разделения.
По порядку подготовки: отмывка водой и потом щелочью должна перевести смолу в ОН^--форму. Последующая промывка водой должна производиться до нейтральной реакции - я с катионитом использовал универсальную индикаторную бумагу.
Не очень понятно, зачем переводить смолу в ацетатную форму. Сможет ли ЭДТА (или её аналог) вытеснить уксусную кислоту со смолы? Впрочем, если надо разделить на этой колонке смесь кислот с разным рК_а - возможно, это правильный подход, настаивать не буду. Возможно, правильнее будет посадить смесь кислот на анионит в ОН^--форме и элюировать уксусом.
"Полости с воздухом" при промывке кислотой после воды (у меня было - при промывке раствором аммиака после воды), равно как и разогрев колонки, говорят о плохой отмывке от щелочи (для катионита - от кислоты).

[Lyol'ka]

Интересно, а зачем промывали метанолом? что бы убрать то, что вышло из смолы за время "простоя"?
И такой вопрос: анионит - это полистирол, модифицированный четвертичными аммонийными солями. Если такую смолу залить щелочью и оставить на сутки или неделю, то появляющийся запах аминов - результат деструкции смолы или из нее вымывается "грязь"?

Смола в форме ацетата выбрана с ориентированием на публикации: там использовали муравьиную кислоту. Поскольку сродство к выбранному аниониту у ацетата и формиата близкие (у формиата даже больше), то за неимением муравьиной использовала уксусную. А разделяю я три кислоты с разным количеством карбоксильных и аминогрупп - делятся, но строгой стабильности в экспериментах нет. В последних двух экспериментах смесь проскакивала, на колонке задерживалось небольшое количество целевой кислоты. вот и думаю, что делать...

[SkydiVAR]

Интересно, а зачем промывали метанолом? что бы убрать то, что вышло из смолы за время "простоя"?

Именно. Честно говоря, не уверен в необходимости промывки метанолом, но старшие коллеги посоветовали делать именно так - если хочу выделить чистую аминокислоту. Метанол доступен, времени отнимает не много - пуркуа бы и не па?

И такой вопрос: анионит - это полистирол, модифицированный четвертичными аммонийными солями. Если такую смолу залить щелочью и оставить на сутки или неделю, то появляющийся запах аминов - результат деструкции смолы или из нее вымывается "грязь"?

Вероятнее всего - и то, и другое. Наверное, не следует хранить смолу в щелочи - лучше в воде в ОН^--форме.

Смола в форме ацетата выбрана с ориентированием на публикации: там использовали муравьиную кислоту. Поскольку сродство к выбранному аниониту у ацетата и формиата близкие (у формиата даже больше), то за неимением муравьиной использовала уксусную.

На том же субстрате или на аналогичном? Если на том же - я бы таки порекомендовал начать с формиата. Альтернативный вариант - как я уже писал, посадить смесь кислот на смолу в ОН^--форме, тщательно отмыть водой от катионов, и только потом смывать уксусом. Предварительно (возможно, меняя методику промывки и/или концентрацию кислоты) добиться отсутствия пузырей при переходе от воды к кислоте.

А разделяю я три кислоты с разным количеством карбоксильных и аминогрупп - делятся, но строгой стабильности в экспериментах нет. В последних двух экспериментах смесь проскакивала, на колонке задерживалось небольшое количество целевой кислоты. вот и думаю, что делать...

Вероятная причина неудач - плохая подготовка смолы и/или плохое качество смолы. Воду не жалейте для промывки.

[chemist]

Аниониты в ОН-форме нестабильны, их нельзя нагревать и долго хранить, распад в основном происходит по схеме:
ArCH2N(+)Me3*OH(-) ---> ArCH2OH + Me3N
Запах аминов даёт триметиламин.
Он вымывается водой, но если ионит гелевый, то из-за диффузионных затруднений, часть остаётся, метанол смывает остатки.

Разделить аж три аниона на ионите - задача не из простых, тут часто и для двух-то условия месяцами не подберёшь...

[SkydiVAR]

Аниониты в ОН-форме нестабильны, их нельзя нагревать и долго хранить

Вероятно, Вы правы - продаются анионитные Дауэксы в форме хлоридов и формиатов. Значит, перед хранением переводить в хлорид, перед применением опять регенерировать... Насчет разделения - тоже согласен.