Модификация гидроксильного остатка в 5-гидроксиметилцитозине

[ДК.]

В ДНК модифицированный цитозин представлен суммой 5-метил и 5-гидроксиметилцитозина, причем фермент (ДНК полимераза) этого различия "не видит".
Вопрос: есть ли варианты избирательной (обратимой или необратимой) модификации по этому гидроксильному остатку в пиримидинах?
Может быть, есть какое-то сходство по реакционной способности этого гидроксила с гидроксилами в тирозине или серине/треонине? Нужно ли защищать аминогруппы в пуриновых основаниях при такой модификации - или их реакционная способность в условиях модификации низка?

[Cycloid]

Ответ - да, нет. Слишком неконкретно сформулирован вопрос. Зависит от того, что Вы хотите делать. При синтезе конкретного соединения (скажем, 5-"защищенного"гидроксиметилцитозина) есть возможность дифференцировать аминогруппы с 5-гидроксиметильной группой. Если речь идет о ДНК, то это уже совсем другой разговор, и дифференцировать 5-гидроксиметил с 5'- и 3'-гидроксилами будет сложнее. Так что Вы хотите делать?

[rombach]

... При синтезе конкретного соединения (скажем, 5-"защищенного"гидроксиметилцитозина) есть возможность дифференцировать аминогруппы с 5-гидроксиметильной группой. ..

Пример приведите, пожалуйста.

[Cycloid]

Да, прошу прощения, я несколько наврал. 5-Гидроксиметильная группа действительно отличается по реакционной способности от остальных и ее можно модифицировать уксусной кислотой или спиртами у 5-гидроксиметилуридина (JOC 1993, 58, 1664-1665). С гидроксиметилцитидином такой фокус не проходит, поскольку в этих условиях идет гидролиз гликозидной связи (NAR 1997, 25, 553-558).

[ДК.]

Ответ - да, нет. Слишком неконкретно сформулирован вопрос. Зависит от того, что Вы хотите делать. При синтезе конкретного соединения (скажем, 5-"защищенного"гидроксиметилцитозина) есть возможность дифференцировать аминогруппы с 5-гидроксиметильной группой. Если речь идет о ДНК, то это уже совсем другой разговор, и дифференцировать 5-гидроксиметил с 5'- и 3'-гидроксилами будет сложнее. Так что Вы хотите делать?

- спасибо за ответы: собираюсь делать, что написала, хотя согласна, похоже на"пойди туда не знаю куда" - поискать, какие избирательные модификации именно по гидроксиметильной группе основания возможны - и проверить, различает ли фермент (желательно, ДНК полимераза) между метилцитозином и этим модифицированным призводным (различать может и ставя что-то иное в дочерней цепи на эту позицию, или синтезируя значительно медленнее, или вообще останавливаясь -здесь трудно что-либо конкретизировать). Дифференцировать между 5-гидроксиметилом и 5'- и 3'-гидроксилами - это не первостепенно - в конце концов из всего два на всю одиночную цепь. А начать хотелось бы с поиска вариантов модификации - если есть варианты.. Похоже, с ними-то как раз не густо.
А что, вопрос о сопоставлении свойств этого гидроксила с гидроксилами в перечисленных аминокислотах совсем "пальцем в небо"? - возможно, это у меня поиск "под фонарем", потому что мне методы белковой химии и модификации ферментов привычнее...

С гидроксиметилцитидином такой фокус не проходит, поскольку в этих условиях идет гидролиз гликозидной связи (NAR 1997, 25, 553-558).

- если я правильно поняла из этой статьи, гидролиз гликозидной связи происходит с гидроксиметилцитозином, а в отсутствии гидроксила -нет? По типу бета-элиминирования -или другой механизм? (Сколько помнится, элиминирование основания наблюдается в щелочной среде...) И что высвобождается? - гидроксиметилированное основание? Из статьи этого не понять - и, к сожалению, нет ссылок. Потому что речь, наверно, об очевидных вещах...

[Cycloid]

А что, вопрос о сопоставлении свойств этого гидроксила с гидроксилами в перечисленных аминокислотах совсем "пальцем в небо"?

В этом случае да, совсем.

Если я правильно поняла из этой статьи, гидролиз гликозидной связи происходит с гидроксиметилцитозином, а в отсутствии гидроксила -нет? По типу бета-элиминирования -или другой механизм? (Сколько помнится, элиминирование основания наблюдается в щелочной среде...) И что высвобождается? - гидроксиметилированное основание? Из статьи этого не понять - и, к сожалению, нет ссылок. Потому что речь, наверно, об очевидных вещах...

В какой-то из этих статей упоминалось, что 5-гидроксиметильная группа при кислотном катализе может превращаться в метиленовую и присоединять нуклеофил. В случае гидроксиметилцитозина расщепление гликозидной связи может проходить, например, вот так:

hmC.gif

В метилцитозине гидролиз также будет идти, но, вероятно, медленнее.

[ДК.]

Большое спасибо, Cycloid, за разъяснения и долготерпение

В какой-то из этих статей упоминалось, что 5-гидроксиметильная группа при кислотном катализе может превращаться в метиленовую и присоединять нуклеофил. В случае гидроксиметилцитозина расщепление гликозидной связи может проходить, например, вот так:

hmC.gif

В метилцитозине гидролиз также будет идти, но, вероятно, медленнее.

- а соединение, которое освобождается после гидролиза гликозидной связи, должно предположительно сохранять структуру пиримидинового кольца? То есть, сугубо теоретически - хотя бы из соображений чувствительности- можно бы превратить его в этено-производное и измерить количество флюориметрически? Ведь, если не ошибаюсь опять, для перегруппировки в этено- производное рибозильный остаток не необходим?

[Cycloid]

а соединение, которое освобождается после гидролиза гликозидной связи, должно предположительно сохранять структуру пиримидинового кольца? То есть, сугубо теоретически - хотя бы из соображений чувствительности- можно бы превратить его в этено-производное и измерить количество флюориметрически? Ведь, если не ошибаюсь опять, для перегруппировки в этено- производное рибозильный остаток не необходим?

Так ведь пурины тоже будут образовывать этено-производные. Или Вы хотите перед модификацией разделить гидролизованное основание гидроксиметилцитозина и негидролизованные остатки и потом модифицировать цитозин?

[ДК.]

- да, я имела в виду, что если, по процитированной Вами статье, из ДНК количественно освобождается гидроксиметилцитозин ( и, возможно, медленнее метилцитозин - как Вы предположили), а негидролизованные остатки сохраняются в цепи ДНК, то отделив от ДНК и получив этенопроизводное того, что из ДНК высвободилось , можно судить о количестве гидроксиметилцитозина? То есть та же "суммарная" информация, что с антителами - а не по положениям "бывшего" модифицированного нуклеотида в последовательности. Но это ЕСЛИ пиримидиновое кольцо сохраняется при таком гидролизе гликозидной связи. Хотя чувствительности все равно, наверно, не хватит...Ведь гидроксиметилцитозин - минорный компонент в ДНК, а ее килограммы, из довольно экзотических тканей, вряд ли будут доступны.

[ДК.]

А с гидроксиламином ничего избирательного не предвидится? - помнится, Э.И. Будовский еще в старом ИБХ много на эту тему работал - но все это в конце 60-х-начале 70-х , и статьи пока не раскопала . А более позднего пока ничего пока не нашла .

[ДК.]

Уважаемые знатоки, помогите, пожалуйста, разобраться 5-hmС.
Наконец, получили оба реагента- d5-hmСTP и d5-mСTP, для работы по синтезу ДНК и проверки специфичных антител. Я еще отобрала аликвоты – на предмет сопоставления, сколько основания освобождается после разрыва гликозидной связи в d5-hmС, чтобы сравнить количество освобождающегося цитозина с данными по связыванию антител для тех же фрагментов ДНК. До ДНК начала, естественно, с самого реагента.
Высушила аликвоту реагента и ресуспендировала в смеси концентрированной уксусной с 1/100 объема ТФУ. Вещество явно не желает растворяться никак ( с дАТФ этой поблемы не было). Через три дня хранения при комнатной – разделила супер и осадок, его растворила в воде. Действительно – большая часть реагента в осадке, в растворе (по ТСХ) очень мало – и никакого гидролиза, судя по ТСХ. ТСХ прогоняла в системе (66volumes isobutyric acid: 18 vol water: 3 vol 30% ammonia solution), как в "родоначальной"статье в “Science” (The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Kriaucionis S, Heintz N., Science. 2009;324(5929):929-30), но они проводили ТСХ на целлюлозе с меченым d-5hmCMP и др. нуклеозидмонофосфаты- а я разделяла на Kiesegel 60 F254 (надеюсь, не здесь ошибка).

Раз никакой растворимости и гидролиза, смешала тогда, без высушивания, 5µl d5-hmСTP(чуть забуферен LiOH производителем) и 10 µl смеси уксусной с ТФУ , pH конечной смеси получилась около 3.0. Не то, что "полного гидролиза", но вообще никакого – ни за 2 часа при комнатной, ни за 1 час далее при 60 град. (да и при последующем хранении трое суток при комнатной темп.), ни при повышении доли ТФУ до 15%.- не появляется цитозин и не уменьшается интенсивность основного пятна, d5-hmСTP. Хотя в статье, на которую любезно дал ссылку Cycloid (NAR 1997, 25, 553-558), стоит "we attempted to selectively acetylate the 5-hydroxymethyl group of 5-hydroxymethyl-deoxycytidine (hmdC) as described previously for hmdU (21); however, we observed quantitative cleavage of the glycosidic bond.", и ссылаются они на Sowers L.C , Beardsley G.P.1993, (JOC,58, 1664-65) . А там только краткая сноска касательно метода: “(15) HMdU 1 was selectively acetylated on the 5-(hydroxymethyl)group by reflux in acetic acid containing catalytic trifluoroacetic acid. The acetylated derivative was isolated by silica gel chromatography in 84% yield”.

В чем может быть дело? – в этом "reflux"? И если да, то как его осуществлять, в чем его назначение - и выполнимо ли, если вещества мало? Или что-то иное неправильно -или "все неправильно"? Не судите строго – я не органик.

[Любитель_Манниха]

reflux- "кипячение с обратным холодильником" Я совсем не в теме, но Вы, кажется, хотите гидролиз, а аффтары при кипячении в AcOH+TFA получают ацетилированное производное

[ДК.]

Я совсем не в теме, но Вы, кажется, хотите гидролиз, а аффтары при кипячении в AcOH+TFA получают ацетилированное производное

- аффтары хотели получить ацетилированное производное, по аналогии с гидроксиметилуридином, а получили количественный разрыв гликозидной связи, когда пытались применить ту же методику к модификации гидроксициметилцитозина. А меня именно это и привлекло - относительная избирательность, если, например, гидроксиметилуридин ведет себя иначе. (Хотя изначально обратилась я сюда с вопросом о возможности специфической модификации - чтобы отличать от метилцитозина, но "по ходу" возник поворот к специфическому разрыву гликозидной связи, что тоже вариант...)

Спасибо за разъяснение по reflux- а в чем преимущества проведения реакции с обратным холодильником по сравнению с просто кипячением: сохранение объема, как мне казалось, или что-то принципиально более важное для реакции? И возможно ли это технически осуществить, например, в пробирке 0.2 мл для ПЦР? (которые выдерживают тоже "почти кипячение" - 95 градусов, хотя, правда, не в кислоте ).

[ДК.]

Спасибо всем за советы. Попробовала воспроизвести "reflux" в ПЦР-машине при 99 град.и пробирке для ПЦР со сферической крышкой (для возвращения конденсата в пробирку). Цитидин образуется за 15 мин уже вполне детектируемо - но практически никакой избирательности по сравнению с метилцитозинтрифосфатом не видно: так что "вопрос закрылся".