Ошибка в синтезе пептидов

[Marionette]

Здравствуйте!

Пишу вам с огромной просьбой о помощи! Уже как с середины сентября в моей лаборатории работа "стоит". Занимаюсь синтезом пептидов - как вручную, так и при помощи синтезирующего аппарата ABI 433A. Использую Fmoc химию.
Проблема заключается в том, что вручную уже как 4 месяца ничего не получается. Принцип таковой: взвешиваю резин, добавляю 2-3 мл DCM для расширения, далее делаю deFmoc, потом добавляю аминокислоту, снимаю deFmoc и т.д. Конечно же в промежутках промываю резин DCM и DMF. В самом конце при помощи химикатов снимаю все защитные группы с резина и убираю сам резин. В итоге остается пептид. Только вот проблема в том, что после получения пептида я иду измерять его массу. Однако спектра я не вижу, что обозначает только то, что на резин не прикрепилась ни одна кислота.
Кто-нибудь может сталкивался с такой проблемой или может что-то посоветовать? Перепробовала уже разные способы и методы синтеза - ничего не помогает. Заказали также новые химикаты - результат тот же....

В надежде на помощь,
Юлия

[maks]

прийдет коллега Upstream и выведет все на чистую трифторуксусную , а пока вопрос от пептидного дилетанта ,
в вашей желаемой пептидной последовательность ароматические аминокислоты есть ? если есть суньте пептид предпологаемый под УФ лампу может все таки светит , а масс наоборот глючит

[SkydiVAR]

Удивительно,но факт: гексапептид, защищенный по обоим концам (Boc + дициклопропилметанол) с двумя фенилаланинами в УФ почти не виден... Только фосфорномолибденовая...

[maks]

Удивительно,но факт: гексапептид, защищенный по обоим концам (Boc + дициклопропилметанол) с двумя фенилаланинами в УФ почти не виден...

действительно интересно

Только фосфорномолибденовая...

ну пусть так , чем не вариант

[Vanya Ivanov]

В виде чего продукт р-р, масло, лиофильн. порошок? Если есть что взвешивать, то чего проще? Сдайте свой, так называемый, "продукт- полипептид" на LCMS с двумя-тремя детекторами - 5 мин и результат готов. Чистота по тсх не всегда самый лучший советчик.

[maks]

... Чистота по тсх не всегда самый лучший советчик.

безусловно, но как
можно понять топикстартера так , что у нее вообще там ничего нет после промывок
может и нет, вот она и в масс- спектре ( и действительно в каком приборе она не наблюдает ?)
может ей ТСХ поможет в принципе понять есть ли чего
или ЯМР если доступен
но вообще реплики Юлии желательны

[matroskin]

Юлия! Позвольте полюбопытствовать, а что за смола, на которой ведёте синтез? (Ванг, Ринг, али другая экзотика?)
...или другое что с уже пришитой C-концевой аминокислотой.

Сразу после снятия FMOC-защиты с аминофункции надо делать тест на наличие свободных NH2-групп (Тест Кайзера). Нет аминокислот, нет и положительной реакции. Таким образом, Вы сможете понять, что хотя бы на стадии синтеза у вас нет проблем.

Что подразумевается под "делаю deFmoc" а потом "снимаю deFmoc"? Вы с какими аминокислотами работаете? С защищёнными?

Чем снимаете FMOC-защиту?

Пептид от смолы, надо полагать, отщепляете TФУ в присутствии всякого рода "катионных ловушек", типа этандитиола и т.д.

И потом, это смола остаётся на фильтре, а пептид смывают, как правило смесью ацетонитрил-вода с добавлением ТФУ (от случая, к случаю). Что же за материю Вы имеете после лиофилизации? Кроме пептидов, там более ничего быть не может, ибо все реагенты, используемые на стадии отщепления пептида от смолы, отмываются эфиром вместе с остатками ТФУ.

Масс-спектр не даёт массы? Или что? Какие аминокислоты в пептиде? Есть-ли возможность снять УФ-спектр или сделать ВЭЖХ? Какова молекулярная масса пептида?

[Marionette]

Эмм... пишу вам со своей проблемой из Эстонии. То есть работаю в эстонской организации, и все реагенты у нас только на английском. Училась я также в эстонском ВУЗЕ и к сожалению сокращения типа ВЭЖХ, ТСХ я к сожалекнию, не понимаю.
К теме: matroskin видимо меня понимает полностью. Делаем на Ванг и Ринг смолах.
Фразы "делаю deFmoc" и "снимаю deFmoc" обозначают одно и то же. Извините за мою непостоянность. Fmoc защиту снимаю 25% пипередином в DMF *диметилформамид*. Также все АК у нас уже с защитой. Тест я тоже делаю, только у нас он Нинхидриновый тест называется. Два реагента - две капли. При свободных NH2-концов шарики окрашиваются в синий цвет. При отсутствии - желтый. Пептид отщепляю TFA,H2O, TIS и при наличии метионина или цистеина добавляю еще EDTA.
В общем в отщеплении проблемы быть не может, потому что параллельно я делаю синтезы в синтезаторе и после прикрепления последней АК и снятия защиты начинаю отщерление, то есть реагенты все точно такие же и их количество тоже.
УФ-спектра именно в нашей лабе я не наблюдала.
NMR или же ЯМР в университете есть, но мне он не доступен.
После лиофелизации у меня по идеи остается чистый пептид. Но последние 4 месяца от ручного синтеза остается 0,1 мг непонятно чего!
По поводу теста на свободный NH2-концы: тест работает замечательно. После каждого прикрепления АК - желтый. После снятия защиты - синий и т.д. То есть как часы. Только вот глазом видно, что на смолу в основном-то ничего и не наростает...
Масс спектр находит массу, но допустим если масса пептида есть 1700 единиц, то МС показывает какие-то непонятные массы 425 и 649 например...

[matroskin]

Юлия! Чудес не бывает. Давайте разбираться.
На смоле Ванга "дефмокирование" перед "посадкой" С-концевой аминокислоты делать не надо.
Иная картина со смолой Ринка. Там на конце FMOC-NH-R. Полагаю, Вы работаете с последней, ибо пептид с С-конца Вам необходимо получить в амидной форме. Тогда перед пришиванием первой АК FMOC-защиту со смолы необходимо снимать. Опишите пожалуйста, как пришиваете первую АК к смоле.

1700...это аминокислот 15 наверное. Да, смола значительно должна прибавлять в объёме при прохождении всей последовательности. Попробуйте высушить смолу с пептидом до отщепления (естественно, предварительно её высушив), и после (тоже высушив). Посмотрите на разницу. На мой взгляд, использование трисов и ЭДТА - излишне. Сколько воды берёте (соотношение с ТФУ)? Надеюсь, не греете при отщеплении?

Погодите, так Вы делаете одну и ту же последовательность на одной и той же смоле на синтезаторе...и получаете отличный от ручного синтеза результат?

p.s. ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC по-англицки)
ТСХ - хроматография в тонком слое (TLC)

[Marionette]

1. Мы делаем как на Ванг, так и на Ринк смоле. Описываю начальную стадию на смоле Ринк: синтез по шкале 0,6ммол. Взвешиваю 170мг Ринк-Амида. Далее добавляю примерно 3-4мл DCM. 30 минут на расширение. Далее разумеется снимаю Fmoc - 25 мин 25%пипередин/DMF. Тестирую - результат негативный (синие шарики) - присоединяю первую АК. Например Аланин (по шкале 0,6 ммол взвушиваю 190мг). Сначала в тюбик с АК добавляю 600микрол 1M HOBt/DMF + 1200микрол 0,5M TBTU/DMF. Все это дело хорошенько перемешиваю до полного растворения АК и добавляю к резину. Перемешиваю 10сек резин с добавленной к нему АК и добавляю к ним 200микрол DIEA для активации присоединения.
2. Присоединение Ванга описывать не буду, там все намного сложнее. Выясняется, что проблема не в смоле, потому что синтез не получается ни на Ринк, ни на Ванг смоле.
3. Для отщепления смолы используем след. реагенты: на 300мг смолы (вместе с АК последовательностью) беру 4,575мл ТФУ + 0,75мл ТИС + 0,25мл H2O. При отщеплении не греем, кидаю магнит и ставлю раствор на магнитный мешатель. Воды получается примерно 5,5%. Сразу скажу, что проблема и не в отщеплении, т.к. отщепление синтеза с аппарата происходит отлично на все 100%.
4. Одна и та же последовательность, то есть ставлю картриджы с АК в синтезатор, задаю программу и он работает. В конце выдает результат. Также делаю все то же только вручную. В конце получаю результат. Только синтезатор делает все правильно (после отщепления измеряю МС и она совпадает с нужной), а синтез вручную "провалился".

HPLC мы делаем с целью очистить пептид от примесей. Нельзя (нет смысла) использовать HPLC когда на МС не видно даже близко правильной массы и когда после лиоферизирования остается 0,1мг "пептида".

matroskin, мы грешим на новые химикаты. (Под новыми я имею в виду то, что в сентябре закончился HOBt и мы заказали новый. Пришел новый - сделали новый растворы для синтеза) Еще у нас сломался аппарат, на котором перемешивали всю смолу с АК последовательностью. Теперь я использую Вортекс (на него просто поставила доску, которая вместе со смолой "качается"). Думали, вдруг такие резкие движения в разные стороны не нравятся смоле? Но говорят, что вроде не должно мешать.

Спасибо за помощь!

[matroskin]

Юля! Добрый день! Вечером доберусь до своих старых записей и посмотрю, чего и как.
В присоединении первой аминокислоты к Вангу ничего сложного нет. Добавляется только использование диметиламинопиридина. Вот и всё!
Я правильно Вас понял, что с карбодиимидами не работаете? А зря...
По поводу перемешивания бьли у нас одни опасения. Но это касалось магнитного привода, когда мешальник разбивал смолу в пыль. Не совсем понятно, как постоянно работающая качалка особенно будет влиять на качество проведения реакции. Тот же синтезатор у нас программно взмучивал время от времени реакционную массу. Но это, например делалось раз 10 в течение 10-15 секунд за один акт присоединения. В ручном же режиме 4-5-кратного интенсивного встряхивания вполне хватало. Кстати, в речном режиме синтез ведёте в реакторе (цилиндрические воронки со стеклянными фильтрами в нижней части и краником для фильтрации)?

По поводу реагентов...можете хоть температуры плавления их померять, если на что грешите...Тот же HOBt (кстати, Вы там случаем не гидрат-ли его приобрели?) или ТBTU. Не поленитесь, сделайте.

Также отказываюсь полнимать, какой тайный смысл в использовании HOBt, когда применяете в качестве конденсирующего агента и так ичего не рацемизующие производжные тетрафторборатов O-бензтриазолилмочевин.

Однако, до вечера...

[matroskin]

Что значит "Синтез по шкале 0,6ммоль"? Как известно, стандартная смола Ринка имеет плотность реакционных групп-линкеров, равную 0,3-0,6ммоль на 1г смолы. Следовательно, для синтеза 0,6ммоль конечного продукта необходимо брать от полуграмма до грамма смолы. Вы же берёте 170мг. Тогда что всё это значит?

Во всяком разе, по окончании последовательности вы должны иметь смолу, масса которой почти в 2 раза превышает исходно взятую перед началом синтеза. Пептида же должно быть не менее 100мг уж точно.

А подозрений, связанных со смолой НЕТ?

[Marionette]

Смолу берем по следующему принципу: на этикетке написано Loading 0,61mmol/g. То есть, если мы делаем по шкале 0,1ммоль это значит 0,1ммоль/0,61ммоль/г=0,164г=164мг. Со смолой не может быть подозрений по одной простой причине - в синтезатор используем точно таккую же смолу и в таких же количествах.
У нас не воронки (то есть форма не воронки). Наверху закрывается пробкой, внизу стеклянный фильтр и решулятор слива.
Петида я и получаю 100мг, вот только при синтезе на синтезаторе. Раньше получала также и при ручном синтезе пока он не перестал действовать.
Сегодня начинаем пробовать "новый" синтез, то есть с реагентами которые использует синтезатор. Вместе ДМФА возьмем NMP (метил-2-пюролидон). Если данный метод будет рабоать, то останется только оджин вывод - ДМФА был испорчен.

Будут новости - напишу.

[matroskin]

Юлия!
Вы меня шокируете! Первое, что обычно в подобных случаях проверяется - растворители и реагенты!
ДМФА можно было и перегнать при пониженном давлении...При нормальном разлагается при Tкип.
Вполне возможно, что примеси вторичных аминов (диметиламин) играют злую шутку...

С уважением, Вадим.

[maks]

Вполне возможно, что примеси вторичных аминов (диметиламин) играют злую шутку...

имеется ввиду что диметиламин вместо пиперидина снимает Fmoc ?

[matroskin]

2) maks

А чем ещё может болеть пациент, учитывая вышеозвученную симптоматику.

Пиперидин и диметиламин...весьма похожие реагенты относительно снятия Fmoc.

Юлия правильно говорит. Если в NMP всё получится, то причина, действительно, в паршивости DMF...

[maks]

сколько же может быть диметиламина в DMF если он был какой нибудь сигмовский , как Юлия описывает в Эстонии реагенты все западные ,
хотя может действительно с бутылкой не повезло
надо бы носом понюхать не пахнет ли аминами

[matroskin]

2) maks
В этой ситуации, я бы всё проверил..
Ещё бы воду поискал...

[StYV]

Уже на следующий день в очищенном ДМФА (способ очистки взят из "Органикума" под ред. Коста) появляется диметиламин - определено с помощью ГЖХ. Количество правда не определяли - такая задача не стояла.
С уважением StYV.

[nikkochem]

Эх. 15 аминокислот - это 30 стадий (считаю ацилирование и снятие защиты). Думаю проблема в недостаточном выходе продукта присооединения на каждой стадии. Например простой подсчет, что при выходе на каждой стадии 99% в итоге получаем суммарный выход около 75%. Если выход например 95% на стадию, то сумарный выход 21%. Если 90% то суммарный выход 4%. На стадии ацилирования не жадничайте - загружайте в разы больше аминокислоты и конденсирующего реагента. На стадии дефмокирования не помешает контроль остаточных эфирных групп на ИК.