Реакция EDC HCl и NHS друг с другом в воде без присутствия карбоновой кислоты

[Мириада]

Нет, то, что я синтезирую тоже показывает биологическую активность - в этом плане все нормально. Да, вероятно, амидная связь не образуется, но в итоге инсулин все равно держится за счет того, что все покрывается хитозан-глюкозным кополимером. - эту часть мне запретили трогать

Единственный вопрос, как уменьшить количество образующихся побочных модификаций инсулина с EDC.

Я вижу это так - EDC так много, что его часть не гидролизуется и не успевает прореагировать с меркаптопропионовой кислотой на наночастицах и модифицирует инсулин.

НЕ понимаю, почему порядок добавления NHS и EDC и скорость добавления инсулина к раствору с наночастицами, NHS, EDC при pH 10 влияет на количество этих побочных модификаций с EDC. Мочевина ведь не реакционноспособна, она не может реагировать с инсулином.

[Nickolas]

Нет, то, что я синтезирую тоже показывает биологическую активность - в этом плане все нормально. Да, вероятно, амидная связь не образуется, но в итоге инсулин все равно держится за счет того, что все покрывается хитозан-глюкозным кополимером

Ну тогда вообще хорошо - можно EDC не добавлять и не будет побочных продуктов. Тут уже собственный патент вырисовывается

Единственный вопрос, как уменьшить количество образующихся побочных модификаций инсулина с EDC.

Ну тут два варианта: либо отделять частицы от избытка реагента перед добавлением инсулина, как вам уже написали. А центрифугированием ваши частицы осаждаются? Если да, то можно потом их еще раз промыть, открутить и в бой..
А второй вариант, это квенчить избыток реагента, так как он модифицирует ваш инсулин.

Я вижу это так - EDC так много, что его часть не гидролизуется и не успевает прореагировать с меркаптопропионовой кислотой на наночастицах и модифицирует инсулин.

Его все равно нужен избыток, поэтому его всегда будет много.

НЕ понимаю, почему порядок добавления NHS и EDC и скорость добавления инсулина к раствору с наночастицами, NHS, EDC при pH 10 влияет на количество этих побочных модификаций с EDC. Мочевина ведь не реакционноспособна, она не может реагировать с инсулином.

EDC медленно гидролизуется, именно поэтому его и используют в водных растворах.
Некоторые тонкости реакции с EDC есть в том документе, ссылку на который я вам присылал. Там описан, например, оптимальный pH для каждой из стадий, а также квенчинг..

[Мириада]

А есть ли какое-то представление, насколько быстро образуется о-ацилмочевина и затем NHS-эфир?

Хотя, я же проверила, эти две побочные модификации инсулина появляются независимо от наночастиц с меркаптопропионовой кислотой.
Добавление NHS первым и добавление инсулина быстрее помогает уменьшить их образование как в присутствииб так и в отсутствие MPA-квантовых точек

[Nickolas]

А есть ли какое-то представление, насколько быстро образуется о-ацилмочевина и затем NHS-эфир?

Как правило, образование O-ацилмочевины зависит от ряда факторов: строения кислоты, pH (ближе к нейтральному быстрее), полярности растворителя (в гидрофобных быстрее), температуры и тд..
Далее судьба O-ацилмочевины тоже может быть разной, например, может образовываться N-ацилмочевина и другие побочные продукты..

[Мириада]

Я думала, наоборот, что EDC достаточно быстро гидролизуется, но скорость гидролиза, я полагаю, определяется pH? Гидролиз при pH должен быть очень высокий?

Я использую диализ сразу после конъюгации и после первого цикла диализа концентрация побочны продуктов увеличивается, а после второго цикла диализа можно видеть, что эти примеси начинают вымываться.

Не знаю, насколько логична моя гипотеза, но образец после диализа всегда становится немного более разбавленный, а значит концентрация побочных продуктов может вырасти только в том случае, если побочные реакции продолжают идти внутри диализной установки. При этом мы знаем, что именно EDC дополнительно модифицирует инсулин. Значит, EDC не вымывается достаточно быстро и продолжает реагировать с инсулином. И это логично потому что я провожу динамический диализ в режиме рециркуляции, а не в режиме single pass mode, когда диализат не возвращается.

Все вроде бы логично, но я думала почему-то, что EDC моментально гидролизуется в воде особенно при pH 10.
И я не могу понять, если за первый цикл концентрация инсулина уменьшилось на 15%, то как возможно, что количество одного побочного продукта увеличилось на 40% и второго на 55% - это ведь модификации инсулина (для расчета использовался HPLC-UV метод и сравнивались AUC). Образец был один и тот же, просто аликвоты брались в разное время для анализа.

Неужели EDC HCl выживает даже после нескольких часов диализа

Что думаете?

[Jokermaniak]

И я не могу понять, если за первый цикл концентрация инсулина уменьшилось на 15%, то как возможно, что количество одного побочного продукта увеличилось на 40% и второго на 55% - это ведь модификации инсулина (для расчета использовался HPLC-UV метод и сравнивались AUC).

Так это проценты, рассчитываемые от разных баз. Для инсулина - от концентрации инсулина, для примесей - от концентрации примесей, абсолютные значения которых вам неизвестны. Повторюсь - то, что вы получили на HPLC для примесей - это концентрация в попугаях, HPLC (в вашем случае) не является количественным методом. У вас может быть так, что примесей было по 1%, а стало 1.4 и 1.55, соответственно.

Неужели EDC HCl выживает даже после нескольких часов диализа

Нет, EDC гидролизуется довольно медленно. Иначе бы его не использовали в воде. А рН 9-10 - это стандартные для него условия. Чтобы побыстрее отбиться от EDC, надо в single pass диализовать, конечно. А у вас диализуемый раствор циркулирует, или он в мешке/кассете?

[Nickolas]

Неужели EDC HCl выживает даже после нескольких часов диализа

Сильно зависит от того, что у вас в растворе, а также какой у раствора pH.

A dimethylbarbituric acid reagent has been used to follow the kinetics of loss of two water-soluble carbodiimides, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and the structurally related 1-ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl) carbodiimide (EAC), in aqueous solution as a function of pH and added chemical reagents. In 50 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid at 25 degrees C, EDC has t1/2 values of 37, 20, and 3.9 h at pH 7.0, 6.0, and 5.0, respectively, while the corresponding values for EAC are 12, 2.9, and 0.32 h.Iodide, bromide, or chloride, at 0.1 M, has very little or no effect on carbodiimide stability. However, 0.1 M glycine methyl ester or 0.1 M ethylenediamine causes a significant increase in the rate of loss of EAC and EDC, while the presence of 0.1 M phosphate, 0.1 M hydroxylamine, or 0.01 M ATP decreases the half-lives to less than or equal to 0.4 h at all pH values.

DOI:

http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(90)90675-y

[Мириада]

[/quote]

Не знаю, насколько логична моя гипотеза, но образец после диализа всегда становится немного более разбавленный, а значит концентрация побочных продуктов может вырасти только в том случае, если побочные реакции продолжают идти внутри диализной установки. При этом мы знаем, что именно EDC дополнительно модифицирует инсулин. Значит, EDC не вымывается достаточно быстро и продолжает реагировать с инсулином. И это логично потому что я провожу динамический диализ в режиме рециркуляции, а не в режиме single pass mode, когда диализат не возвращается.

У меня установка для динамического диализа с перистальтическим насосом.
Изначально было два цикла (23 и 16 часов - оба в режиме рециркуляции,
Мои данные по анализу реакционной массы после первого и второго цикла диализа показывают, что концентрация инсулина за первый цикл снижается, количество EDC-модифицированных инсулиновых фракций увеличивается, после замены воды, за второй цикл инсулин и обе побочные фракции начинают дальше вымываться примерно с одинаковой эффективностью, что логично, поскольку их молекулярные массы практически идентичны.

Буду теперь прогонять первый цикл в single-pass mode (16 часов, 100 мл/мин попробую), потом буду переходить на второй цикл часов 4-8 в recurcullation mode (или лучше и после первого цикла single-pass mode использовать? - думаю большая часть EDC HCl будет удалена за первый цикл

Я вижу тут еще одну проблему - авторы методики почему-то использовали 10 kDa мембраны (Mw инсулина 5.8 kDa). Учитывая, что молекулярный вес чистого инсулина и двух побочных продуктов практический одинаковый и все фракции вымываются примерно с одинаковой скоростью, но чем больше инсулина остается в конечном продукте, тем лучше, было бы разумнее использовать 6-8 kDa мембрану, чтобы не терять много инсулина. Тем более, количество побочных фракций , как было показано экспериментально, определяется в значительно мере скоростью добавления инсулина, порядком добавления NHS, EDC, ну и конечно скоростью вымывания EDC во время первого цикла диализа.

[Мириада]

Нет, EDC гидролизуется довольно медленно. Иначе бы его не использовали в воде. А рН 9-10 - это стандартные для него условия. Чтобы побыстрее отбиться от EDC, надо в single pass диализовать, конечно. А у вас диализуемый раствор циркулирует, или он в мешке/кассете?

Будет ли разница между динамическим диализом в режиме рециркуляции и обычным статическим диализом?

[Мириада]

И я не могу понять, если за первый цикл концентрация инсулина уменьшилось на 15%, то как возможно, что количество одного побочного продукта увеличилось на 40% и второго на 55% - это ведь модификации инсулина (для расчета использовался HPLC-UV метод и сравнивались AUC).

Так это проценты, рассчитываемые от разных баз. Для инсулина - от концентрации инсулина, для примесей - от концентрации примесей, абсолютные значения которых вам неизвестны. Повторюсь - то, что вы получили на HPLC для примесей - это концентрация в попугаях, HPLC (в вашем случае) не является количественным методом. У вас может быть так, что примесей было по 1%, а стало 1.4 и 1.55, соответственно.

Неужели EDC HCl выживает даже после нескольких часов диализа

Нет, EDC гидролизуется довольно медленно. Иначе бы его не использовали в воде. А рН 9-10 - это стандартные для него условия. Чтобы побыстрее отбиться от EDC, надо в single pass диализовать, конечно. А у вас диализуемый раствор циркулирует, или он в мешке/кассете?

Концентрация инсулина определяется с помощью калибровочной кривой, построенной с использованием стандарта инсулина.

Да, концентрации двух побочных модификаций не могут быть определены в настоящее время (структуры пока не идентифицированы полностью).
Но чтобы отслеживать, как изменение реакционных условий вляет на соотношение между разными фракциями инсулина, я могу сравнивать AUC (area under curve). То есть, если в контрольном эксперименте у нас сигнал примеси составлял 300 000, а при изменении какого-то параметра он стал 400 000, то я же могу видеть, что содержание примеси увеличилось на 33% (при условии, что анализ проводился в идентичных условиях). Хотя здесь мы также принимаем, что отклик для этих побочных исулиновых фракций линейный

[Jokermaniak]

Будет ли разница между динамическим диализом в режиме рециркуляции и обычным статическим диализом?

Зависит от того, как устроена установка. В целом, рециркуляция диализата даст более высокую скорость массопереноса, но равновесная концентрация удаляемых веществ всë так же определяется отношение объемов. Самый быстрый массообмен в проточных установках с single run потоком диализата и рециркуляцией диализуемого раствора, причем там концентрация уходит в ноль за одну итерацию.

[Мириада]

Исходя из Вашего опыта, какой порядок добавления реагентов предпочтительнее?

В литературе часто встречается, что сначала добавляют NHS; кто-то предварительно растворяет NHS и EDC в воде и вводит их в виде растворов, а кто-то добавляет их в виде порошков.

Я спрашиваю, потому что мои дополнительные эксперименты показали, что добавление NHS первым или одновременно с EDC приводит к увеличению концентрации немодифицированного инсулина и снижению концентрации инсулинов, модифицированных EDC. Это может быть связано с более быстрым и эффективным образованием NHS-эфиров, либо с тем, что часть EDC просто реагирует с NHS без образования эфиров (как показал Cherep). В любом случае, чем больше EDC тратится на побочные реакции, тем меньше остаётся его для модификации инсулина.

В предложенной мне методике к 4,7 мл концентрированного водного раствора наночастиц добавляют примерно 870 мг EDC и 930 мг NHS, и только затем разбавляют всё до 200 мл водой.

Я всё это время сначала диспергировала наночастицы в воде, а затем добавляла EDC, а после него - NHS.