Анализ пептидов

[FOX-7]

Ув. Коллеги! Можно ли как-то измерить общее содержание пептидов в неком образце (желательно химический способ).

[avor]

Аминокислоты и первичные амины в этом образце присутствуют?
1) самый инструментальный способ.
Гидролизуем 6М HCl в ампуле под аргоном и на аминокислотный анализатор.
2) Тот же гидролизат можно совокупить с нингидрином и померить на СФ.
3) вместо нингидрина можно использовать редкий и малодоступный ортофталевый альдегид (чувствительность выше), но нужен флуориметр.
4)Не менее редкий и дорогой флуорескамин его можно прямо с пептидами мешать(гидролиз не нужен), но опять нужен флуориметр(сюда же относятся и методы с дансилхлоридом)
5)Красивый инструментальный метод с фенилтиоизоцианатом. Можно получить тиогидантоиновые производные только N-концевых аминокислот.Потом сделать ВЭЖХ, если у вас есть маркерные гидантоины всех АК, то можно еще узнать сколько и каких у вас там пептидов(при условия знаний о том, какие они там вообще должны быть)
6)Биуретовая реакция с медным купоросом реакция довольна специфична на пептидную связь, но мало чувствительна.
7)Чувствительность биурктовой реакции можно существенно повысить, если использовать так называемый метод с Бицинхоиновой кислотой(BCA-метод)

[Joni-Fantazi]

Государственная фармакопея СССР. Выпуск 2
Там порядка 10 методов.

[FOX-7]

Государственная фармакопея СССР.

avor, спасибо, очень интересно! Но вопросы остались. Дело в том, что имеем бульон. Вот и стоит задача определить сколько там пептидов. Какие не знаем. Можно ли в такой смеси количественно оценить именно пептидное содержание?
Сейчас используем 6-ой метод. Похоже имеет смысл обратить внимание на 3, 4 и 7.

[avor]

Бульен! А что это такое?
1. Осветлённый отвар мяса(или других органов животного происхождения).
2. Питательная среда для микрорганизмов на основе гидролизатов белка.
3.Сам гидролизат неких белков
4.Некий холодный осветленный белковый экстракт из живой ткани или микроорганизмов, предназначенный для дальнейшей очистки и многостадийной переработки или уже прошедший некие стадии переработки.
5. Реакционная смесь из под хим синтеза пептидов.

Короче что там в этом бульоне кроме пептидов? есть ли полипетитды? если другие источники азота(аммоний, аминокислоты)? Вас интересуют именно пептиды до 10-30 АК или все пептиды и полипептиды в смеси?

[FOX-7]

Интересуют все пептиды в смеси, подходит вариант 4. Это реально или там будут мешать другие источники азота?!

[avor]

О! Ну это просто. обычно для такой шняги используется три метода. Брэдфорд, Лоури, и бицинхоиновая кислота с медью..

Все они имеют свои ограничения и недостатки.
метод Брэдфорд на основе связывания кислотного шерстяного красителя Кумасси ярко- синий примянять можно только краситель G(зеленоватый), краситель R(красноватый, гомолог зеленоватого) не подходит по физико-химическим свойствам. Аминокислоты ему не мешают, зато сильно мешают ионные ПАВ и в меньшей степени не ионные, высокие концентрации SH- реагентов типа унитиол, ДТТ, меркаптоэтанол, высокие концентрации щелочей. Преимущество этого метода быстрота и высокая чувствительность, еще недостатком является зависимость градуировки от АК состава белка.

Лоури работает на основе реактива Фолина(мод Чикольте) смесь ФВК и ФМК. Преимущества: не влияют ионные ПАВ, чуть менее чувствителен чем Брэдфорд, но определение длительное, мешают все восстановители, фенолы, -SH- реагенты, ПЭГ алкилфенолы(неионные ПАВ типа ОП10 или неонол, Тритон Х-100), тоже зависим от АК состава но в меньшей степени чем Кумасси.

Метод с бицинхоиновой кислотой BCA преимущества: работает на пептидную связь(практически не зависит от АК состава),относительно быстрый даже быстрее Брэдфорд, чувствительный. Мешают все вещества взаимодействующие с медью: ЭДТА, роданиды, SH-реагенты, высокие концентрации солей аммония и тд, тп, Пав влияют незначительно.

[Joni-Fantazi]

Ну первые два как раз в фармакопее имеются. По нашим образцам Лоури обычно сильно завышает кол-во белка, потому юзаем Бретфорда. Ещё пробовали Седмака, он аналогичен Бретфорду, но тоже не совсем понравился.
Очень желательно иметь чистый белок, который будете определять в вашей смеси, в качестве стандарта.
А где можно почитать про "Метод с бицинхоиновой кислотой BCA"?

[avor]

А где можно почитать про "Метод с бицинхоиновой кислотой BCA"?

Пардон, у вас трудности потому что я не правильно пишу название бицинхониновая

http://www.piercenet.com/instructions/2161296.pdf
http://molbiol.ru/protocol/17_07.html
http://www.helicon.ru/catalog/detail.ph ... NT_ID=2238
http://www.vekton.ru/e_sale/?gd=18725

Да, в свете выше сказанного, я бы переименовал тему в "Определение концентрации общего белка"

[Joni-Fantazi]

avor, спасибо!

[FOX-7]

Да, avor, благодарствуем!