Гидролиз белка
Re: Гидролиз белка
--Ну, тогда растворы чистых аминокислот должны быть кислыми, а это не так.
Вы в этом уверены? Я точно знаю, что глицином закисляют раствор трис-(гидроксиметила)аминометана
Вы в этом уверены? Я точно знаю, что глицином закисляют раствор трис-(гидроксиметила)аминометана
Re: Гидролиз белка
Что значит "либо-либо", что добавляете на самом деле-то и сколько?Arrenius писал(а):Ну после приготовления суспензии белка в воде рН где то 6, я довожу до оптимального 7,5 и после прибавления фермента поддерживаю прикапывая либо аммиак либо слабую щелочь. Так что какой рН после ферментации не знаю, т.к. сам его регулирую.
Зря. А титрант не мешало бы проверить, т.к. подозрительно это.Arrenius писал(а): Было только одно обратное титрование, второе не делал, т.к. не вижу в нем смысла. Скачки не различимы.
А "аммиак либо слабая щелочь", значит, есть хорошо?Arrenius писал(а): все что я добавлю в раствор (буферы, протекторы и т.д.) останется в товарном продукте, что не есть хорошо.
I D E A = A u
Re: Гидролиз белка
Не закисляют, а доводят до нормы, т.к. сам по себе раствор ТРИСа довольно щелочной (в районе 10).avor писал(а): Вы в этом уверены? Я точно знаю, что глицином закисляют раствор трис-(гидроксиметила)аминометана
I D E A = A u
Re: Гидролиз белка
Я рад что вы меня поняли, несмотря на мою попытку ввести вас в заблуждение.chemist писал(а): Не закисляют, а доводят до нормы, т.к. сам по себе раствор ТРИСа довольно щелочной (в районе 10).
На самом деле не совсем до нормы(хотя что такое "норма"), а где-то до рН-8,3, но с 10 или даже более высокой. Но в любом случае рН понижают.
Re: Гидролиз белка
Ну с изоэлектрической точкой 5.97 - можно и закислять, хотя еслиchemist писал(а):Не закисляют, а доводят до нормы, т.к. сам по себе раствор ТРИСа довольно щелочной (в районе 10).avor писал(а): Вы в этом уверены? Я точно знаю, что глицином закисляют раствор трис-(гидроксиметила)аминометана
Re: Гидролиз белка
В первых экспериментах прикапывал аммиак, т.к. в случае сушки или упаривания его избыток просто улетучится, но в последних рН уже равнял щелочью. Не могу точно обосновать почему, но просто почесав левой рукой правое ухо, подумал что натриевые соли карбоновых кислот, все таки более часто встречаются в пищевой промышленности, чем аммонийные. Количество тоже не засекаю, просто прикапываю до оптимального рН и все.chemist писал(а):Что значит "либо-либо", что добавляете на самом деле-то и сколько?Arrenius писал(а):Ну после приготовления суспензии белка в воде рН где то 6, я довожу до оптимального 7,5 и после прибавления фермента поддерживаю прикапывая либо аммиак либо слабую щелочь. Так что какой рН после ферментации не знаю, т.к. сам его регулирую.
Проверить на что??? На концентрацию? Даже если допустим там плюс миную 5% на что это повлияет? Скачки не делятся.chemist писал(а):Зря. А титрант не мешало бы проверить, т.к. подозрительно это.
А что в них плохого, если они расходуются только на солеобразование с карбокси группами и избытка нет? Т.е. самой щелочи в сухом продукте после сушки не будет.chemist писал(а):А "аммиак либо слабая щелочь", значит, есть хорошо?
Re: Гидролиз белка
Это несерьёзно, т.к. наука начинается там, где есть измерения. А Ваши манипуляции с ушами и руками пусть объясняют родные и близкиеArrenius писал(а):просто почесав левой рукой правое ухо
Количество тоже не засекаю, просто прикапываю до оптимального рН и все.
Не надо ничего допускать, просто проверить стандарт-титром и всё!Arrenius писал(а):Проверить на что??? На концентрацию? Даже если допустим там плюс миную 5% на что это повлияет? Скачки не делятся.chemist писал(а):Зря. А титрант не мешало бы проверить, т.к. подозрительно это.
Скачки не обязаны делиться, а вот точка эквивалентности может сдвинуться и её значение - основа для расчётов
I D E A = A u
Re: Гидролиз белка
ЭЭЭ! Летучий буфер с относительно близкой к физиологическим рН пиридин ацетатный. Не дешев, но. Пиридин 100мл ЛУК-4 мл довести до литра рН=6,5, думаю можно разбавить еще больше.
Аммония бикарбонат в районе концентраций 25-60мМ буферит в районе 8 Дешево и сердито очень популярно.
Аммония бикарбонат в районе концентраций 25-60мМ буферит в районе 8 Дешево и сердито очень популярно.
Re: Гидролиз белка
Спасибо за совет! Может скоро пригодится!
Мне рН 7,5 нужен, так что ацетат пиридина наверно не очень подходит.
Мне рН 7,5 нужен, так что ацетат пиридина наверно не очень подходит.
Re: Гидролиз белка
А подскажите, как вообще можно определить белок денатурированный или нет?
Re: Гидролиз белка
Ну я знаю два более или менее надежных способа.Arrenius писал(а):А подскажите, как вообще можно определить белок денатурированный или нет?
1)По активности(например ферментной)
2)По изменению спектра кругового дихроизма, но здесь нужен спектр нативного не денатурированного белка в качестве стандартного образца сравнения.
Так же на денатурацию могут реагировать спектры флуоресценции белка, изменяется гидродинамический радиус, но эти изменения могут быть и заметными, и не очень, зависит от конкретного белка.
Re: Гидролиз белка
Ужас!)))
Ладно, зайду с другой стороны. Когда я провожу гидролиз в довольно разбавленной суспенции, то вроде все нормально, но когда я пытаюсь подобрать наименьшее количество воды при котором процесс таки идет, то если после видимого окончания реакции (примерно час) оставить при перемешивании реакционную смесь на продолжительное время при нагреве, то она начинает коричневеть и сильно густеть, вплоть до образования пластилиноподобной массы. Вот я и думаю не денатурация ли это непрореагировавшего белка?
Ладно, зайду с другой стороны. Когда я провожу гидролиз в довольно разбавленной суспенции, то вроде все нормально, но когда я пытаюсь подобрать наименьшее количество воды при котором процесс таки идет, то если после видимого окончания реакции (примерно час) оставить при перемешивании реакционную смесь на продолжительное время при нагреве, то она начинает коричневеть и сильно густеть, вплоть до образования пластилиноподобной массы. Вот я и думаю не денатурация ли это непрореагировавшего белка?
Re: Гидролиз белка
Если температура не высокая, то всякая микроживность может завестись
Их можно рассмотреть в микроскоп
Их можно рассмотреть в микроскоп
I D E A = A u
Re: Гидролиз белка
Денатурация практически на 100% здесь не причем. Покоричневение, это почти с уверенностью можно сказать, результат карамелизации( результат реакции аминогрупп аминокислот с альдегидными группами примесных сахаров). Так же карамелизация частично пособствует загущению. Но больше всего, я подозреваю, что загущению способствует либо набухание и ратворение зерен примеси крахмала. Либо набухание и растворение зерен суспензии белка.Arrenius писал(а):Когда я провожу гидролиз в довольно разбавленной суспенции, то вроде все нормально, но когда я пытаюсь подобрать наименьшее количество воды при котором процесс таки идет, то если после видимого окончания реакции (примерно час) оставить при перемешивании реакционную смесь на продолжительное время при нагреве, то она начинает коричневеть и сильно густеть, вплоть до образования пластилиноподобной массы. Вот я и думаю не денатурация ли это непрореагировавшего белка?
Re: Гидролиз белка
Лишь немногие протеазы (вроде Проназы и Протеиназы К) способны гидролизовать до аминокислот.
Что же касается хода гидролиза...
Титрование - не самый лучший способ
Поскольку исходный белок, насколько можно судить, плохо растворим и смесь мутная, то удобно смотреть по просветлению раствора.Короткие полипептиды растворимее исходных белков. Есть даже такая экспресс-методика определения активности протеиназ по "яичному молоку". То есть разбавленный яичный белок нагревают почти до кипения и он мутнеет. От протеиназ такая суспензия просветляется и по времени достижения эталонной прозрачности можно судить об активности фермента. Из оборудования нужны - пипетки,пробирки и газета (смотреть читаемость шрифта через пробирку).
Второй вариант - осаждаем белок кислотой (любой, хотя бы соляной. обычно берут трихлоруксусную или хлорную), центрифугируем. Осадок растворяем в щелочи и определяем белок любым подходящим методом. Например биуретовым. По мере гидролиза доля осаждаемого белка падает.
Что же касается хода гидролиза...
Титрование - не самый лучший способ
Поскольку исходный белок, насколько можно судить, плохо растворим и смесь мутная, то удобно смотреть по просветлению раствора.Короткие полипептиды растворимее исходных белков. Есть даже такая экспресс-методика определения активности протеиназ по "яичному молоку". То есть разбавленный яичный белок нагревают почти до кипения и он мутнеет. От протеиназ такая суспензия просветляется и по времени достижения эталонной прозрачности можно судить об активности фермента. Из оборудования нужны - пипетки,пробирки и газета (смотреть читаемость шрифта через пробирку).
Второй вариант - осаждаем белок кислотой (любой, хотя бы соляной. обычно берут трихлоруксусную или хлорную), центрифугируем. Осадок растворяем в щелочи и определяем белок любым подходящим методом. Например биуретовым. По мере гидролиза доля осаждаемого белка падает.
Кто сейчас на конференции
Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 28 гостей