реактив Фолина для опред. белка по Lowry

[Demiurg]

Здравствуйте!

Хотелось бы с помощью уважаемой общественности форума разобраться в следующих вопросах:
1) реактив Фолина и реактив Фолина-Чокальтеу (Чикольтеу, Чикольте) - это одно и то же или нет? Точнее, одинаково ли они "работают" при определении белка (есть ли разница, что использовать)?
Прописи приготовления этих реактивов (http://www.xumuk.ru/encyklopedia/2/4800.html) мне мало что говорят. Может, различие только в способах приготовления, а так это одно и то же ("работает" одинаково)?
2) как определить концентрацию этих реактивов? Вроде как используется титрование чем-то. Я при поисках у себя в лабе обнаружил реактив Фолина (производства НТК Анализ-Х, химфак БелГосУниверситета). Про концентрацию на этикетке ничего не указано, но кем-то от руки подписано 125 N. Получается, если этому верить, он 125-нормальный? Сам реактив 2002 г. выпуска, осадка никакого нет, цвет - бледно-желтый с зелёным оттенком (хранился все время в холодильнике, в стеклянной бутылке из темного стекла).
В методике, которую я собираюсь использовать, написано что нужен реактив Фолина-Чокальтеу (2 моль/л), который перед использованием разбавляют водой (1:5, т.е. концентрация рабочего реактива 0,4 моль/л). А как тогда для этих реактивов пересчитывать нормальность в молярность?

Спасибо!

[Дмитрий Подкопаев]

Метод Лоури фотометрический. Для определения белка нужно будет построить калибровку по известному белку. Вы просто попробуйте построить калибровку с Вашим реактивом, на этом этапе сразу станет понятно рабочий он или нет и в каких диапазонах работать. С концентрацией придется гадать,т.к. непонятна концентрация Вашего раствора и непонятна концентрация белка в Ваших пробах.

[Iskander]

1 Реактивы немного разные, в первую очередь из-за лития. Для Лоури нужен Фолин-Чикольтеу, так как литий - хаотроп, а точного анализа нужна развёрнутая конформация белка.

2 Используется титрование щёлочью. Вроде как классический должен быть 1М, хотя что это такое в приложении к гетерополикислотам сказать трудно.
Идеальный цвет раствора - жёлтый, но лёгкий зелёный оттенок не помеха. Главное, чтоб не синий.

Концентрация в принципе не столь важна. Я использовал и неразбавленный раствор. Важна скорее итоговая концентрация его в растворе, то есть если раствор концентрированный - берём 100 мкл, более разбавленный - 200-300. А вообще, всё определяется калибровкой.

Метод Лоури весьма капризный, чтобы получить на нём точные и воспроизводимые результаты нужно прилично пошаманить.

[Demiurg]

Мне нужно определять общий белок в гомогенатах тканей и препаратах мембран. Насколько мне известно, метод Лоури (в модификации Петерсона) оптимизирован как раз для этого. В прописи методики указывается, что используется именно реактив Фолина-Чокальтеу (2 моль/л).
В Практикуме по биохимии (под ред. Северина и Соловьёвой, МГУ 1989 г.) говорится, что кислотность реактива Фолина-Чокальтеу определяют титрованием разведенного в 10 раз реактива 0,1 н. щелочью в присутствии фенолфталеина. Это я и попытался сделать (в 50 мЛ разведенного реактива добавил 10 капель 1% раствора фенолфталеина в 60%--ом этаноле), но перехода окраски не уловил. Точнее наблюдалось вот что: сперва, при добавлении щелочи (в месте попадания капель в раствор) наблюдалось локальное розовое окрашивание, которое при перемешивании исчезало; чем больше щелочи я добавлял, тем все более зеленым и затем синим становился титруемый раствор; в итоге, после добавления 150 мЛ 0,1 н щелочи (гидроксид натрия) мне это надоело (к этому времени цвет раствора стал темно-синим, на грани сиреневого). Отмечу, что это был (исходя из информации на этикете) реактив Фолина. Возможно, точки эквивалентности я достиг, но розовая окраска оказалась замаскирована.
Я заказал себе реактив Фолина-Чокальтеу (Sigma F9252). Он имеет концентрацию 2Н. Но заполучу я его относительно не скоро. Если кто-то может предложить альтернативу модификации Петерсона (в контексте определения белка в гомогенатах и мембранах) - охотно "выслушаю", на Lowry "свет клином не сошелся". Хотя это будет определяться наличием-отсутствием у меня соответствующих реактивов (есть реактивы для метода по Брэдфорд, для биуретового метода и нингидриновый реагент).

[avor]

По моему вы слишком много жарнули ФФ. У вас спирт похоже окислялся в процессе титрования. Если не поможет меньшая доза ФФ, можно попробовать больше чем в 10 раз развести реактив фолина перед титровнием. Кроме того можно оттитровть просто по рН-метру до рН-10-11. Возможность увидеть переход окраски можно просто тестировать на очень маленьких аликвотах добавля к ним небольшой избыток щелочи.

[Demiurg]

Avor!
Спасибо за рекомендации! Собственно, я решил оттитровать имеющийся у меня реактив Фолина по рН-метру (до рН 10-11). И вот что получилось:
Взял 5 мЛ исходного реагента и довел его в объёме точно до 50 мЛ бидистиллятом (т.е. разбавил в 10 раз). Разбавленный реактив Фолина исходно имел рН 1,49 (при 28 гр. Ц.). Титровал из бюретки свежеприготовленным 0,1 Н раствором NaOH при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке. Поначалу рН защелачивался очень туго (примерно на сотую долю от одной капли из бюретки). Но после достижения рН примерно 3,80 дело пошло легче. Дотитровал до 10, но в районе этого значения довольно долго еще пришлось играться с раствором в “тяни-толкай”, поскольку рН все норовил “сплыть” ниже 10. Потом дотитровал и до 11 (при этом рН уже практически не проявлял тенденции к сдвигу в кислую область). В итоге раствор стал прозрачным, с легким синим оттенком (если смотреть на белом фоне). Добавил в него 5 мкЛ 1%-го раствора фенолфталеина в 60%-ом этаноле – сразу проявилось устойчивое бледно-розовое окрашивание.
В итоге на достижение рН (50 мЛ с исходным рН 1,49) до 10 ушло 143,6 мЛ 0,1 Н раствора NaOH, до 11 – 160,9 (плюс еще 17,3 мЛ после рН 10).
Если я правильно считаю, то:
Cэкв. К-ты*Vк-ты=Сэкв. Щел.*V Щел Cэкв. К-ты*0,05 = 40*0,1436, откуда Cэкв. К-ты:
Cэкв. К-ты = (Сэкв. Щел.*V Щел)/ Vк-ты = (40*0,1436)/0,05 = 114,88 моль экв/л (для расчета по рН 10)
Cэкв. К-ты = (40*0,1609)/0,05 = 128,72 моль экв/л (для расчета по рН 11)
Получается, что оттитрованный реактив Фолина где-то 115-130 Н(ормальный), а исходный (не разбавленный) – 1150-1300 Н(ормальный). В принципе, это согласуется с тем, что я приводил в своем стартовом посте (про кем-то подписанную от руки концентрацию в 125 Н).
Как тогда эту нормальную концентрацию пересчитать в молярную?
Реактив Фолина представляет собой водный р-р H7[P(W2O7)] и (иногда) Н7[Р(Мо2О7)6]. Получается (условно), что реактив Фолина 14-тиосновный? И тогда установленную нормальную концентрацию реактива нужно делить на 14?

[avor]

Что-то вы мудрите больно. По вашим результатам у вас примерно 3N реактив.

[Demiurg]

Значит, рассчитал неправильно.
Уважаемый Avor! А Вы не могли бы привести Ваш расчет? Нет, я не сомневаюсь в его правильности, но очень хотел бы посмотреть как правильно рассчитывать.

[avor]

100мл 1N кислоты нейтрализуются 100мл 1N щелочи - это главный постулат.

Вы берете 50мл разбавленной в 10 раз кислоты и титруете 0.1N раствором щелочи, если кислота 0,1N, то у вас уйдет на нейтрализацию 50мл щелочи, а у вас ушло примерно 150мл, т.е. в 3 раза больше, значит кислоты было в 3 раза больше чем в 0.1N растворе, т.е. ее концентрация 0.3N, а вы ее разбавили в 10 раз, значит концентрация исходной кислоты 3N.

[hongma]

Здравствуйте
Вы, похоже, действительно сильно переусложняете жизнь самому себе. Метод Лоури довольно неточный. Для неизвестной смеси белков результат будет весьма среднепотолочный. Коэффициенты поглощения для разных белков различаются в разы, а вы их знаете для каждого мажорного компонента? Поэтому для определения АБСОЛЮТНОГО содержания белка он малопригоден без калибровки по другим методам (уж хотя бы по биуретовому, если нет Кьельдаля ). Поэтому не заморачивайтесь, и помните, что вы можете сравнивать по содержанию белка смеси близкого состава и тут особой разницы какой реактив, Ф или ФЧ, нет. Ну, чувствительность будет чуть побольше или поменьше, но не принципиально.

[Iskander]

Метод Лоури весьма точен, но довольно капризен.

Коэффициенты поглощения для разных белков различаются в разы, а вы их знаете для каждого мажорного компонента?

Это для Бредфорда, в котором коэф поглощения зависит от молярной массы белка. В случае Лоури - образуется молибденовая синь, вне зависимости от размера белка, только в некоторой зависимости от его восстанавливающей способности, которая, как правило, различается мало.

Поэтому для определения АБСОЛЮТНОГО содержания белка он малопригоден без калибровки по другим методам (уж хотя бы по биуретовому, если нет Кьельдаля )

Ну, я в осадке. Какой нафиг Кьельдаль? Он же не различает белки, аминокислоты, ДНК и прочие метаболиты. Это метод очень приблизительный, единственное преимущество которого - экспресс-анализ вне зависимости от источника и состава пробы.

[Дмитрий Подкопаев]

Возможно немного оффтоп, но методы определения белка по Кьельдалю, Лоури и Бредфорду могут давать сильно непохожие друг на друга результаты. Наверно наилучший вариант для сравнения - анализ аминокислот после гидролиза. Мне все таки кажется что истина познается на практике, пока не попробуешь - не узнаешь.

[Vanya Ivanov]

сильно непохожие друг на друга результаты.

Эти методы используются для разных целей.
Вообще то, метод Кьельдаля - это не метод определения белка, а метод определения общего азота, хотя часто и используется в химии белка. Для начала.
Причем здесь различия в экстинции и молекулярном весе разных белков? У вас каша в голове .... Если Вы определяете мол экстинцию самого белка при 254 нм, тогда да, это важно.
И брэдфорда и лоури дают абсолютно одинаковый результат. Ну просто построй их по одной и той же калибровке, но в среднем диапазоне концентраций ..
Метод лоури основан на измерении пропорции окраски комплекса и точность его зависит только от точности калибровки и др. случайных ошибок. Метод лоури - лишен систематической ошибки в концентрациях около 1 мг/мл до 0.25 мг/мл для нативных белков. В меньших концентрациях нативных белков нужно использовать Бредфорда - Проверенно годами. Метод бреэфорда и возник как более чувствительное дополнение к обычным методам. Все калибруются по BSA. Завтра доберусь до лабы скину источник по методам, там правда на англ но все просто и ясно. утверждено FDA и принято у нас в ГФ от рождества Христова.

[Vanya Ivanov]

Определяйте концентрацию белка просто и правильно! Удачи.

Quantitation of Proteins.pdf

[Дмитрий Подкопаев]

сильно непохожие друг на друга результаты.

Эти методы используются для разных целей.
Вообще то, метод Кьельдаля - это не метод определения белка, а метод определения общего азота, хотя часто и используется в химии белка. Для начала.
Причем здесь различия в экстинции и молекулярном весе разных белков? У вас каша в голове .... Если Вы определяете мол экстинцию самого белка при 254 нм, тогда да, это важно.
И брэдфорда и лоури дают абсолютно одинаковый результат. Ну просто построй их по одной и той же калибровке, но в среднем диапазоне концентраций ..
Метод лоури основан на измерении пропорции окраски комплекса и точность его зависит только от точности калибровки и др. случайных ошибок. Метод лоури - лишен систематической ошибки в концентрациях около 1 мг/мл до 0.25 мг/мл для нативных белков. В меньших концентрациях нативных белков нужно использовать Бредфорда - Проверенно годами. Метод бреэфорда и возник как более чувствительное дополнение к обычным методам. Все калибруются по BSA. Завтра доберусь до лабы скину источник по методам, там правда на англ но все просто и ясно. утверждено FDA и принято у нас в ГФ от рождества Христова.

Вот здесь важно отметить, что методы дают одинаковый результат, если простая матрица (тупо белок в воде). Я к сожалению, в своем посте не написал, что при исследовании сложных матриц (например экстракты растений) результат будет сильно разный. Это отражено (мешающие вещества) в файле, который Вы прикрепили. Поэтому для сложных матриц метод надо подбирать. И референтный метод также придется подбирать. У автора, насколько я понимаю гомогенаты клеток

[Vanya Ivanov]

это да, в говногенатах там .... да много сопутствующего ... нужно будет пере- или просто осадить белок все же тху .... прям по методике.
А вот что такое референтный метод ..... референтный к чему, к лоури или бредфорду

[Demiurg]

Про мешающие вещества при определениях белка какими-угодно методами (interfering compaunds):
viewtopic.php?f=16&t=97510

Затевая текущий пост, я ориентировался, в основном, на метод Лоури (в тех или иных его модификациях) как позволяющий определять белок в тканевых гомогенатах и препаратах мембран (плазматические мембраны, микросомы), что мне в ближайшее время и нужно будет делать.
Метод М. Брэдфорд не способен солюбилизировать мембраны и вытаскивать "на свет божий" мембраноассоциированные белки, т.е. вроде как применим только для определения водорастворимых (гидрофильных) белков. Хотя, наверное, можно предварительно обработать гомогенаты и мембранные препараты детергентами и перевести мембранные (говоря шире - гидрофобные) белки в раствор (кому интересно - см. "методичку" от Abcam, в ней приведены рецепты всяких белок-экстрагирующих буферов). Но тут возникает проблема этих самых interfering compaunds - метод М. Брэдфорд дает перекрёстную реакцию с довольно широким спектром детергентов (ионных, неионных, хаотропных) - SDS, всякие Triton'ы (в частности широко употребительные Triton X-100 и NP-40), дезоксихолат Na, мочевина. С этим тоже можно побороться (удалить мешающие компоненты диализом, концентрированием), но если удалять детергенты, которые перевели гидрофобные белки в раствор, они (белки) ведь выпадут в осадок, т.е. вновь станут водонерастворимыми... Метод Лоури, в противоположность методу М. Брэдфорд, гораздо менее чувствителен к детергентам (он чувствителен ко всякого рода восстанавливающим агентам - сахара, полифенолы и т.д.).
По поводу того, что и сколько определяют методы количественного анализа белка, так по моему дилетантскому мнению ни один из существующих методов (кроме аминокислотного анализа и взвешивания сухого белка) не даёт безупречно корректных результатов, если только калибровка не проводилась по белковому раствору, состав которого ИДЕНТИЧЕН таковому у изучаемого образца (что, в большинстве практических случаев не достижимо). В сущности, в большинстве случаев измеряют не абсолютную, а относительную (относительно использованного стандарта) концентрацию белка. В итоге: конечный результат будет зависеть от выбора стандарта (методы Брэдфорд, Лоури и др. колориметрические), либо определяться сознательно принятыми допущениями (как в случае УФ-спектроскопии, где таким допущением является "утверждение" что на 280 нМ поглощают только белки - такое допущение хорошо в случае водного белкового раствора, в то время как в УФ-области поглощением обладают даже многие обычно применяемые буферы (Tris, HEPES, цитрат, глицин и пр.)).