Поделитесь рецептом буффера для лизиса клеток

вопросы современной биологической химии, молекулярной биологии, химической энзимологии и смежных наук
biochem, molbio, chemical enzymology and related discussions for professionals
Ответить
ch3coooh
Сообщения: 27
Зарегистрирован: Чт май 30, 2013 7:29 pm

Поделитесь рецептом буффера для лизиса клеток

Сообщение ch3coooh » Ср апр 18, 2018 3:08 pm

Приветствую вас, коллеги.
Столкнулась со следующей проблемой, начала делать эксперименты на пролиферацию клеток при помощи окрашивания Кристаллическим фиолетовым, но после всех процедур по протоколу не могу растворить клетки для того, чтобы вытащить из них тот самый краситель.
Гугл говорит, что это 1% раствор SDS, что представляет собой ничто иное как додецил сульфат натрия. Послушав гугл, я, не долго думая, навела такой раствор. Однако, ничего не растворилось. Если копать глубже, можно найти на различных ресурсах множество рецептов, в состав которых, помимо SDS входит Трис и соли. Но нет никакой однозначности в концентрациях.
Прошу помощи у вас, может кто-то имел счастье сталкиваться с подобным.

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 10268
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Поделитесь рецептом буффера для лизиса клеток

Сообщение avor » Ср апр 18, 2018 6:55 pm

Протокол окраски кристал виолетом выложите. Да! И клетки какие?

Polychemist
Сообщения: 8828
Зарегистрирован: Вт дек 21, 2004 11:42 am

Re: Поделитесь рецептом буффера для лизиса клеток

Сообщение Polychemist » Чт апр 19, 2018 6:59 am

Просто из любопытства, а что такое "эксперименты на пролиферацию клеток"? Просто рост культуры? Красить для выявления мёртвых? Краситель потом вытаскивать для фотометрии?

ch3coooh
Сообщения: 27
Зарегистрирован: Чт май 30, 2013 7:29 pm

Re: Поделитесь рецептом буффера для лизиса клеток

Сообщение ch3coooh » Пн апр 23, 2018 12:45 pm

avor писал(а):
Ср апр 18, 2018 6:55 pm
Протокол окраски кристал виолетом выложите. Да! И клетки какие?
Протокол вполне стандартный, честно говоря, других и не видела в интернете.

1. Фиксация клеток 4% формальдегидом 10 минут
2. Промывание PBS 3 раза
3. Окрашивание Кристал фиолетовым 0,5% в MeON/H2O 20/80 10 минут
4. Обильное промывание водой
5. Сушка 5-12 часов
6. Добавление детергента
7. Измерение поглощения при 570 нм

клеточные культуры HeLa и CHO

ch3coooh
Сообщения: 27
Зарегистрирован: Чт май 30, 2013 7:29 pm

Re: Поделитесь рецептом буффера для лизиса клеток

Сообщение ch3coooh » Пн апр 23, 2018 12:48 pm

Polychemist писал(а):
Чт апр 19, 2018 6:59 am
Просто из любопытства, а что такое "эксперименты на пролиферацию клеток"? Просто рост культуры? Красить для выявления мёртвых? Краситель потом вытаскивать для фотометрии?
Да, фотометрия.
И нет, это зависимость количества клеток от концентрации вещества.

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 10268
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Поделитесь рецептом буффера для лизиса клеток

Сообщение avor » Пн апр 23, 2018 12:56 pm

А зачем клетки фиксировать формалином? После формалина их никакой SDS не возьмет. Клетки суспензионные?
Вот CSHL рекомендуют клетки не фиксировать, а краситель экстрагировать чистым метанолом, а не SDSом.
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

hongma
Сообщения: 331
Зарегистрирован: Пн апр 18, 2005 10:56 pm

Re: Поделитесь рецептом буффера для лизиса клеток

Сообщение hongma » Вс апр 29, 2018 7:39 am

Там нет лизиса клеток. После формалина никакой СДС ничего не лизирует, он нужен для отдирания кристаллвиолета от белков.
И, собственно, в чем проблема? Никакого прироста окраски не видно?

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 10268
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Поделитесь рецептом буффера для лизиса клеток

Сообщение avor » Вс апр 29, 2018 10:37 am

:D

ch3coooh
Сообщения: 27
Зарегистрирован: Чт май 30, 2013 7:29 pm

Re: Поделитесь рецептом буффера для лизиса клеток

Сообщение ch3coooh » Чт май 03, 2018 2:05 pm

hongma писал(а):
Вс апр 29, 2018 7:39 am
Там нет лизиса клеток. После формалина никакой СДС ничего не лизирует, он нужен для отдирания кристаллвиолета от белков.
И, собственно, в чем проблема? Никакого прироста окраски не видно?
В том и дело, что ничего не происходит. Раствор прозрачный, клетки фиолетовые.
Я нашла в лаборатории лизис буффер от какого-то набора, он оказался вполне рабочим, но его волшебный состав это тайна за семью печатями, а количество тает на глазах.. Знаю только то, что на банке написано - KDalert Lysis Buffer.


Я тут еще попробовала поэксперементировать, добавила к СДС Трис и довела pH до 8, стало получше, но поглощение все равно не дотягивает до этого самого лизис буффера (если сравнивать один и тот же 96-луночный планшет). :(

Ответить

Вернуться в «биохимия и молекулярная биология / biochemistry and molecular biology»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 0 гостей