Сходимость стандартных образцов (ВЭЖХ)

[Mikele]

Всем доброго времени суток.

Надеюсь, не слишком промахнулся с разделом форума. Работаю в фарм. лаборатории; как правило, растворы стандартных образцов готовим в двух параллелях. Соответственно, встаёт вопрос с оценкой близости результатов инжекций СО 1 и СО 2. На прошлом месте работы этот расчёт выполняли в экселе, оценивая RSD между отношениями (средняя площадь по n заколам)/(взятая навеска стандартного образца). Одна формула, вбитая в расчётную форму, что-то вроде:

=СТАНДОТКЛОН(S1/a1;S2/a2)*100/СРЗ(S1/a1;S2/a2)

нормировка не более 2 %, в целом, довольно кошерно.

Там же, где работаю сейчас, ситуация обстоит немного по-другому. Чётких рекомендаций в нормативных документах нет, и близость приготовленных растворов стандартов оценивают по-разному. Чаще всего - делят друг на друга отношения (средняя площадь по n заколам)/(взятая навеска стандартного образца) и выражают в процентах; при этом не оговаривается, бОльшее или мЕньшее значение должно быть в знаменателе, как следствие, в одном и том же случае у разных людей может получиться как 99,хх %, так и 100,yy %. Альтернатива - взять по модулю разницу между полученным значением и сотней. Т.е., если, опять же, брать экселевские формулы, получается, соответственно,

=S1*a2*100 /(a1*S2)

или

=ABS(S1*a2*100 /(a1*S2) - 100)

И нормируется это дело тоже в пределах 98-102% (или не более 2,0 %). Правда, норма передаётся изустно и документально не закреплена.

И вопрос знатокам: какой подход является более правильным? Есть ли какая-то нормативная литература, где это было бы прописано? Мне не сложно, хоть тремя способами посчитаю, если будет нужно, но хотелось бы внести ясность в вопрос. Заранее спасибо откликнувшимся.

[Mikele]

Пусть градуировочный график зависимости концентрации от площади пика описывается линейной функцией вида y=b*x+a, где у - концентрация, х - площадь пика, b, a - коэффициенты. Предположим, что прямая выходит из начала координат, т.е. a=0, тогда y=b*x. И Вы находите, таким образом, отклонение коэффициента, если же говорить языком математики, то тангенса угла наклона прямой. Если а=0, то еще интереснее становится искомый Вами параметр. Это все, конечно, можно загнать под определение пересчетного коэффициента, но зачем оценивать его СКО? Фактически Вы пытаетесь не результаты анализа сравнивать, а унифицировать отклики разных детекторов - не вижу смысла в том.

Полагаю, Вы не совсем верно поняли мой вопрос (или же я непонятно выразился или ошибся в терминологии). Простите, но при чём тут коэффициенты пересчёта, линейности, какая-то унификация и прочее? Мы говорим не о валидационных тестах, а о банальных, рутинных ежедневных задачах. Один день, один хроматограф, один, естественно, детектор и один анализ, допустим, банальное количественное определение активного компонента в препарате. Я готовлю два раствора стандартного образца (да, каждый раз новые растворы) и хочу исключить ошибки разведения, взятия навески СО и т.п. И вот есть две навески стандартного образца (a1, a2), есть усреднённые площади пиков на хроматограммах их растворов (соответственно, S1, S2). Они получены в описанных выше условиях: один день, один прибор. А дальше - как писал выше, разные варианты оценки сходимости стандартов.

[vmu]

Mikele, ваши критерии сходимости можно переписать в следующем виде:
первый (тот, что по RSD)
100·|x₁ — x₂|/(x_ср·√2) ≤ 2
или
100·|x₁ — x₂|/x_ср ≤ 2·√2,
второй
100·|x₁ — x₂|/x₂ ≤ 2,
где x₁ = S₁/a₁, x₂ = S₂/a₂, x_ср = (x₁ + x₂)/2.
[Да, Commander L, x_i по сути является фактором отклика (угловым коэффициентом, тангенсом угла наклона... с точностью до того или иного множителя) для линейной градуировки с нулевым свободным членом; в >99% фарм. анализов именно такая градуировка и подразумевается.]
Видно, что критерии отличаются друг от друга примерно в √2 ≈ 1.4 раза. Второй критерий более жесткий. Если заменить в знаменателе второго критерия x₂ на x_ср, получим почти эквивалентный (т.к. x₁ ≈ x₂ ≈ x_ср) третий критерий:
100·|x₁ — x₂|/x_ср ≤ 2.

Смысл расчета RSD для двух значений неочевиден, и наглядная интрепретация первого критерия затруднительна. Второй критерий интуитивно более понятен.
Что касается предельного значения, то общей рекомедации нет. Для одних задач 2% могут быть адекватной величиной, для других — слишком мягкой, для третьих (например, для определения примесей, где достаточно меньшей точности) — слишком жесткой (тут, возможно, и 5% будет нормально).

В случае простых анализов (определение основного вещества в субстанции) во втором критерии первый из стандартных растворов можно рассматривать как контрольный образец (СО — по сути та же субстанция), а второй стандартный раствор — собственно как рабочий стандартный раствор. Выполнение критерия означает, что найденное содержание компонента в первой навеске по второй навеске лежит в пределах 98—102% от номинального значения. Тем самым вы удостоверяетесь, что при анализе собственно субстанции вы сильно не промахнетесь.

Но теперь представьте себе анализ субстанции, для которой норма содержания основного вещества составляет 98—102%. Сделали вы два стандартных раствора. Получили по второму критерию сходимость в 101.9% или 98.1%, т.е. в пределах вашей нормы. Далее считаете содержание вещества в субстанции по одному из стандартных растворов и получаете, например, 99%, т.е. в пределах спецификации. При расчете же по другому стандартному раствору вы получите либо 101% (тоже в норме), либо 97%, т.е. уже вне спецификации. Можно ли сказать, что сходимость в 2% для двух стандартных растворов в данном случае приемлема? По какому из стандартных растворов считать и какой окончательный результат выдавать: брак или не брак? Более-менее адекватным решением проблемы выбора будет расчет не по x₁ или x₂, а по x_ср, но норма сходимости для стандартных растворов все равно должна быть жестче для этого случая.

Commander L, по поводу APPENDIX 1 – ORA Validation and Verification Guidance for Human Drug Analytical Methods.
Там есть такие фразы:
"Настоящий документ является унифицированным руководством для лабораторий ORA по минимальным требованиям для валидации методик анализа." "Здесь представлены минимальные требования к валидации методик анализа лекарственных средств в лабораториях ORA".

"Правильность. ... Критерии приемлемости: 97,0% -103,0% извлечения для каждого уровня «введено» для АФИ; 95,0% — 105,0% — для готовых лекарственных форм".
Ясное дело, что для субстанции с нормой 98—102% критерий 97.0—103.0% неприменим.

"Прецизионность (сходимость): выполнить 5 повторных введений стандартного раствора аналита при 100% ожидаемой концентрации, если не указано иное. Критерии приемлемости: RSD не более 2,0%, если не указано иное".
Для субстанции с нормой 98—102% (или 99—101%) это RSD в 2.0% только для одних последовательных вводов стандартного раствора (без повторяемости приготовления растворов и т.д.) — слишком мягкая неадекватная норма. В фармакопеях есть несколько более жеские критерии RSD площадей на хроматограммах для субстанций.

[vmu]

Можно ссылку на ОФС? Я что-то не припоминаю такого ни в одной фармакопее.

ОФС.1.2.1.2.0001.15. Хроматография.

[Waters]

В свое время мы крест-накрест пересчитывали площади с навесками. Если укладывались в 2%, то хорошо.

Насчет ОФС "Хроматография". Ее более жесткие критерии - это хорошо, конечно, но коэффициент Стьюдента там берется с доверительной вероятностью 90%. В фарме общепринятая - 95%. Пересчитывать?
Кто установил, что для В=1 максимальное СКО = 0,85? Откуда это значение, если макс. СКО - это расчетная величина на основе этого же макс. СКО?

[vmu]

Waters, формулу из которой в ГФ берутся численные значения предельно допустимого RSD, можно переписать в виде:

Δ_max(P = 0.90) = RSD_max·t_{90 %,n-1}/√n = K·B ≈ 0.35·B (или примерно 1/3 от B).

Левая часть выражения - это полуширина доверительного интервала Δ_max для среднего значения площади пика, выраженная в процентах от среднего. Интуитивно понятная суть этого выражения: если вы хотите достоверно проверить, соответствует ли содержание основного вещества в субстанции требованию 100 ± B %, то будьте добры, обеспечьте прецизионность аналитичского сигнала (выражаемую его доверительным интервалом), которая будет не хуже, чем некоторое предельное значение (в данном случае ≈ 0.35·B ≈ 1/3 от B).
Почему именно 0.35·B, почему именно 90 % доверительная вероятность - не возьмусь сейчас ответить. По-большому счету, этот предел (не более 0.35·B) тоже не такой уж жесткий, учитывая, что речь идет всего лишь о нескольких последовательных хроматограммах одного и того же стандартного раствора. А ведь есть и другие факторы (та же точность приготовления растворов), вносящие свой вклад в неопределенность результата анализа. Какие там "укладывались в 2%, то хорошо" при B = 1 % или даже 2 %... Такая проверка сходимости приготовления стандартных растворов, конечно, лучше, чем отсутствие всякой проверки, однако ее ограниченность тоже нужно понимать.

[Waters]

Сто лет не была на этом форуме, забыла, как цитировать пофразово... Как получится.

Δmax(P = 0.90) = RSDmax·t90 %,n-1/√n = K·B ≈ 0.35·B (или примерно 1/3 от B)

Это я понимаю. В этой формуле меня смущает коэффициент К, который, по факту, предлагается взять константой. Это с учетом значения " 0,6 / корень из 2" равного 0,85 (по таблице).
С чего вдруг? Откуда эта цифра взялась?

Почему именно 0.35·B, почему именно 90 % доверительная вероятность - не возьмусь сейчас ответить.

Если вы работаете в фарме, то наверняка сталкивались с публикациями сотрудников Фармакопейного центра Украины (Гризодуб, Леонтьев...)
Они все допуски рассчитывают через 0,32*В. Вот откуда там берется эта цифра, мне понятно, но выводила я ее давно, поэтому сейчас тоже не воспроизведу. В любом случае, 0,32 - понятная величина, не берущаяся из ниоткуда.

Дальше про 90%. ОФС - это закон для фармы. Однако, в подавляющем большинстве случаев, работаем все-таки с 95%. Тогда, по хорошему, надо эти допуски пересчитывать с учетом другого значения коэффициента Стьюдента. Но тогда возвращаемся к значению В. Откуда ноги растут? почему именно это значение?
Просто по сути СКОмакс это СКО для В=1%, n=6 умноженное на некий коэффициент.
Тогда СКО макс для СКО для В=1%, n=6 это равно СКО для В=1%, n=6 в квадрате.
Мутно написано

Какие там "укладывались в 2%, то хорошо" при B = 1 % или даже 2 %... Такая проверка сходимости приготовления стандартных растворов, конечно, лучше, чем отсутствие всякой проверки, однако ее ограниченность тоже нужно понимать.

Конечно, вы правы. Если мы укладывались в эти 2%, то навески и площади стандарта усреднялись и именно это среднее значение и использовалось в расчетах. Даже осознавая всю ограниченность этих действий, все же это лучше, чем считать по единичным значениям стандарта - об этом коллеги выше писали.

[vmu]

Кто установил, что для В=1 максимальное СКО = 0,85?
Это я понимаю. В этой формуле меня смущает коэффициент К, который, по факту, предлагается взять константой. Это с учетом значения " 0,6 / корень из 2" равного 0,85 (по таблице)

0.6/√2 = 0.424264 ≈ 0.42, и это пределное RSD% для B = 1, а не B = 2. Внимательнее. И учтите, что первична формула, а не таблица. Значения в таблице - результат использования формулы.
То, что K - константа, как раз понятно. Вопрос в величине и происхождении этой константы, в происхождении этих 0.6/√2.

Однако, в подавляющем большинстве случаев, работаем все-таки с 95%.

Не стоит обобщать. Для разных статиститеских задач - разные доверительные вероятности. Например, Q-критерий выявления промахов чаще используют с P = 0.90.

Просто по сути СКОмакс это СКО для В=1%, n=6 умноженное на некий коэффициент.
Тогда СКО макс для СКО для В=1%, n=6 это равно СКО для В=1%, n=6 в квадрате.
Мутно написано

Что в квадрате? RSD_max(n) = RSD_max(6)·(t_90%,5/√6)·(√n/t_90%,n-1)·B.

Если мы укладывались в эти 2%, то навески и площади стандарта усреднялись и именно это среднее значение и использовалось в расчетах.

Полагаю, все-таки усреднялись "S/a" или "a/S", а не "a" и "S". Усреднение - это хорошо. Среднее значение точнее единичных значений.