поломка вискозиметра

[Ptizza]

Уважаемые коллеги. Подскажите, может кто-либо сталкивался с получением неправильных данных в вискозиметре (MICRO--Ubbelohde). Вместо увеличения вязкости раствора он наоборот показывает уменьшение. Прибор простейший, не можем понять что это может быть – реактивы или прибор…. Меняли несколько раз и его составляющие и реагенты а нужные результаты пока не получили.
Заранее спасибо!!!!

[Yulia_Sh]

Это стекляшка, или это прибор? Если стекляшка, то для каких систем измеряете вязкость?

[Ptizza]

Это стекляшка, или это прибор? Если стекляшка, то для каких систем измеряете вязкость?

Прибор состоит из бани с термостатом и U-образной трубки, которая в одном плече заужена. Вязкость измеряется по скорости прохождения раствора в определенном участке плеча. Системы: буферные р-ры с ДНК.

[Hedgehog]

Может, термостат глючит? его калибровали хоть раз?

[Ptizza]

Может, термостат глючит? его калибровали хоть раз?

температуру меряем ртутным термометром, температуру показывает нужную (20 по Цельсию). на счет калибровки не знаю

[Hedgehog]

При измерениях вязкости нужно термостатировать и измерять t с высокой точностью, иначе толку не будет. Найдите хороший термометр с большой шкалой и посмотрите.

[Smol]

У нас на полимерах такое бывает - если к "хорошему" растворителю добавляется еще и "плохой" растворитель, то макромолекулы как бы "сворачиваются в клубок" и вязкость системы падает (и заметно)...
Но могут быть и более простые причины:
1. В капилляре вискозиметра "грязи" быть не может? Которая бы сорбировалась стеклянными стенками и заужала проход? А потом по ходу измерений постепенно бы "вымывалась"?
2. Температуру надо держать ОЧЕНЬ точно, мы для таких дел даже лампочкой (а не ТЭНом) воду в термостате нагревали...
(ТЭН сильный разбег температуры дает, а тут надо не более 0,5 гр.С).
3. И еще - Вы держите каждый раствор в вискозиметре минимум по полчаса до измерения? И совпадают ли между собой параллельные измерения времени истечения одного и того же раствора?
4. А это просто совет - на колбе вискозиметра, погруженной в воду, постепенно образуются пузырьки воздуха. Сгоняйте их (палочкой деревянной), они теплопередачу от воды к раствору нарушают...

[avor]

Системы: буферные р-ры с ДНК.

Оп-па! Вы, что размер(концентрацию) ДНК измеряете по вязкости?! ООООчень дедовский метод. (Ну это так к слову. Я не знаю, что на самом деле вы делаете.)

ЭЭЭЭ. Причина может быть в наличии ДНКазной активности в ваших растворах. Для борьбы с ней обычно используют ЭДТА(или кипятят(автоклавируют) все растворы до внесения в них ДНК), если он у вас уже есть в системе, попробуйте повысить его концентрацию в 2-10 раз, особенно если в системе присутствуют 2 валентные катионы, особенно Mg. Концентрация ЭДТА должна быть на 2-10мМ выше чем концентрация Mg.

[Polychemist]

Да, методику в студию! И в каком месте вязкость уменьшается?

[avor]

У нас на полимерах такое бывает - если к "хорошему" растворителю добавляется еще и "плохой" растворитель, то макромолекулы как бы "сворачиваются в клубок" и вязкость системы падает (и заметно)...
.

Это так. Но в случае ДНК это маловероятно, если это двунитевая не замкнутая ДНК, то эта молекула имеет весьма высокую упругость по длине, а при низких и физиологических ионных силах эта ее особенность усугубляется тем, что она полианион взаимно отталкивающийся сам от себя. При высоких ионных силах эквивалентных 1М и более концентрациям NaCl, гибкость возрастает, но остается все еще довольно существенной.

С остальными замечаниями согласен.

[Smol]

Я с Вами согласен, Вам виднее... Как себя ДНК ведет - я не знаю, поэтому про "полимеры вообще" и написал...

[AndreyS]

Это так. Но в случае ДНК это маловероятно, если это двунитевая не замкнутая ДНК, то эта молекула имеет весьма высокую упругость по длине, а при низких и физиологических ионных силах эта ее особенность усугубляется тем, что она полианион взаимно отталкивающийся сам от себя. При высоких ионных силах эквивалентных 1М и более концентрациям NaCl, гибкость возрастает, но остается все еще довольно существенной.

Persistence Length двухнитевой ДНК на уровне 100-150 оснований. Так что, если ДНК большие (сотни и тем более тысячи оснований), то они вполне себе могут сворачиваться/разворачиваться. Кроме того, могут образовываться ассоциаты.

[avor]

Persistence Length двухнитевой ДНК на уровне 100-150 оснований. Так что, если ДНК большие (сотни и тем более тысячи оснований), то они вполне себе могут сворачиваться/разворачиваться. Кроме того, могут образовываться ассоциаты.

Прочтите внимательно, я нигде не утверждаю, что клубки не образуются. Просто это событие затруднено. А ассоциаты ДНК это прямая дорога к выпадению осадка, например при добавлении спирта.

[AndreyS]

Прочтите внимательно, я нигде не утверждаю, что клубки не образуются. Просто это событие затруднено. А ассоциаты ДНК это прямая дорога к выпадению осадка, например при добавлении спирта.

Ну да, Вы лишь утверждали, что это маловероятно.
Ассоциаты (скорее устойчивые кластеры) не обязательно сразу выпадают в осадок, вполне могут существовать неделями без видимых изменений. Я это не спора для а лишь чтобы отметить, что могут быть и объективные причины для скачков вязкости, не связанные с неисправностью прибора.

[Ptizza]

To Smol, спасибо за ответ. Да, время истечения для одного раствора совпадает. Ждем 5 минут после добавления новой порции р-ра.
Концентрацию так не меряем, просто это один из методов.
Методику знаю на уровне как сделать замер..
К двухнитиевой ct ДНК в BPE буфере добавляется какой-либо классический интеркалятор типа этидиум бромида (я пробовала профлавин) и замеряют вязкость. При добавлении вязкость должна увеличиваться, а она уменьшается как при разбавлении. ДНК, раствор лиганда, и буфер свежие. Раньше метода работала ок, сейчас почему-то нет.
Заранее извиняюсь за недостаточную компетенцию в вопросе. Почему-то мне кажется что проблема тут технического характера..
Да, еще одно, длина цепи ДНК 200-250 нуклеотидов.

[Polychemist]

Чего-то я не понял. Капиллярный вискозиметр прост как валенок, какие там технические проблемы??? Четко опишите, что делаете. Логично делать так:
1. Приготовили раствор той ДНК-ки, поделили пополам, к одной половинке прибавили Ваш интерколятор. Растворы - с избытком.
2. Растворы выдержали в течении времени, потребного для устаканивания, например ночь.
3. Профильтровали растворы, это конечно не светорассеяние, но плотный Шотт нужен.
4. В чистый вискозиметр залили растворитель (буфер), выдержали не менее 15 мин, измерили.
5. Вылили растворитель, 3 раза промыли малыми порциями 1-го р-ра ДНК, залили свежий раствор, выдержали не менее 15 мин, измерили.
6. Вылили раствор (в помойку!), хорошо промыли р-рителем, измерили вязкость растворителя, 3 раза промыли малыми порциями 2-го р-ра ДНК, залили свежий раствор, выдержали не менее 15 мин, измерили.
7. Если данные не соответствуют ожидаемому, повторить все, но р-ры ДНК поменять местами, т.е. сначала мерять 2-й.
Если вязкость буфера не плавает, а данные пп 4-6 и 7 совпадают, но противоречат Вашему смыслу - вязкость измерена правильно, проблема в ДНК-интерколяторе и их взаимоотношениях.

Я написал, как это следовало бы делать. А как Вы делали? Если по писанной/печатной методике - ее сюда, вместе с результатами.

[Ptizza]

с _{профлавин} = 5мМ
с _ДНК = 1.2 мМ
V_aliquote = 20*10^-6 мл
к 2.5 мл ДНК добавляли аликвоты профлавина в BPE буфере.
замер 3 раза (при т-ре 20 по Цельсию) - ожидание 5 минут.
время стекания р-ра для BPE -1.40
BPE+ДНК = 2.44, при добавлении аликвот - 2.41, 2.34 соответсовенно.
Сегодня сошлись на том, что проблема может быть в ДНК.
Методика, как должно получаться - приложена

[Polychemist]

А Вы уверены, что по профлавину Вы попали в концентрации, упомянутые в статье, а не на несколько порядков меньше? И нельзя ли взглянуть на все данные, т.е. на результаты параллельных замеров? Раствор ДНК перед измерением не в холодильнике держали? Сколько минут термостатировали перед началом опыта?

[avor]

К двухнитиевой ct ДНК в BPE буфере добавляется какой-либо классический интеркалятор типа этидиум бромида (я пробовала профлавин) и замеряют вязкость. При добавлении вязкость должна увеличиваться, а она уменьшается как при разбавлении. ДНК, раствор лиганда, и буфер свежие.

Ну тут еще тонкость может в последовательности ДНК. Большинство интеркаляторов избирательны к АТ-богатым последовательностям. Те если у вас GC-богатая последовательность, то связывание может упасть. Ну ДНК-то проверьте, если у вас есть на агарозном форезе.