Выход продукта при ПЦР

[palek]

Возник вопрос. Насколько эффективно могут использоваться нуклеозидтрифосфаты при проведении ПЦР? Т.е. какой можно добиться максимальный процент нуклеозидтрифосфатов вошедших в синтезированную ДНК?

[avor]

Вопрос не ясен. Их(нтф) обычно берут с избытком. Поэтому все не включается по определению.
Что вы имеете в виду под процентом включения. В растворе есть некая концентрация нтф идет синтез, все что включилось то включилось, но НТФ в избытке они не все включились, остатки можно включить в следующем цикле. Процент чего от чего вы собираетесь считать?

Если в реакцию добавлять свежих нуклеотидов, праймеры и фермент потихоньку разбавляя смесь теоретически можно достичь любого близкого к 100%, но не доходящего до них включения(количество синтезированной ДНК будет постоянно расти, а количество НТФ может быть не большим остаточным следовательно количество включенных нуклеотидов по отношению к не включенным будет все время возрастать и стремится к единице в бесконечности. Но это не означает, что включение идет стехиометрически с эффективностью 1.

[palek]

Я в ПЦР на практике не разбираюсь, хотелось бы прояснить для себя аспект эффективного использования нуклеозидтрифосфатов. Догадываюсь, что обычно их добавляют в избытке и больше заботятся об эффективности наработки ДНК, но если один из нуклеозидтрифосфатов будет дорогим (изотопная метка, например) то его уже захочется сэкономить и включить в продукт по максимуму. Под процентом включения я имею ввиду соотношение (нуклеотид в составе ДНК)/(Взятый в реакционную смесь нтф).

[avor]

Да, это все, фигня изотопную метку обычно добавляют в смеси с холодной просто, если ее добавить в такой же концентрации, как обычно, то никаких денег не хватит. А если в меньшей, (т.е. в 10 и 100раз), то будет ингибирование реакции. Поэтому добавляют смесь холодного и горячего нуклеотида при этом относительно не включенной метки можно достичь, весьма большого процента включения, а вот относительно удельного включения (активность на г ДНК), все не так идеально как хотелось бы.

[palek]

Не, под изотопной меткой я имею ввиду, например, введение 15N меченого нуклеотида.

[avor]

Но на суть выше сказанного, это не как не влияет.

[palek]

ОК. Понятно. Спасибо за обьяснение. Интересно, в литературе есть практические примеры расчёта такой эффективности использования нтф-ов?

[avor]

В литературе есть практические протоколы для включения метки в ПЦР реакциях. Они конечно еще зависят от характера метки и условий ПЦР и их много наверное можно найти в pubmed'e.

[Iskander]

А если метку вводить в праймер? Или её требуется напихать много?

Правда синтез олигов тоже идёт с немалыми избытками реагентов...

[palek]

А если метку вводить в праймер? Или её требуется напихать много?

Правда синтез олигов тоже идёт с немалыми избытками реагентов...

У меня теоретический интерес ). Будет ли ПЦР экономичным путём наработки ДНК именно с точки зрения расхода реактивов. Достижима ли "экономия атомов" так сказать ). Я так понял, что ПЦР может очень эффективно использовать нтф-ы, в идеале на 99.99... %.

[avor]

Все познается в сравнении ПЦР хороша для микромасштабов. Как только речь заходит о литрах и кубометрах, с ПЦР возникает куча проблем. К тому же все еще и цена нтф совсем не малая, например в сравнении с питательной средой LB. Те если ДНК наращивать в плазмидах или бактериафагах в граммовых и килограмовых количествах это будет гораздо дешевле и эффективней ПЦР.

[palek]

Понятно. Спасибо!

[Iskander]

Я так понял, что ПЦР может очень эффективно использовать нтф-ы, в идеале на 99.99... %.

Нет, если есть желание получить работоспособную ДНК. То есть израсходовать нтф можно, но ДНК из последнего цикла тогда будет недоросшей.

[palek]

Меня интересовал порядок величины. Как в органическом синтезе - выход продукта хороший, средний, плохой. В данном случае, похоже, можно считать что добиться хорошего и очень хорошего выхода возможно.

[avor]

Если говорить об элементарном акте включения в оптимальных условиях, то эффективность по сравнению с орг синтезом, просто фантастическая и выход близок к количественному.