Извлечение более 100% при ТФЭ

[klinerru]

Добрый день,

ситуация: при проведении твердофазной экстракции (конъюгированные стероиды из мочи) были получены значения степеней извлечения более 100%. Причем в зависимости от образца мочи извлечение 5 определяемых соединений изменялось от 70 до 120 %.
Испробовала разные полимерные сорбенты (обращенно-фазовые), проверили все стадии на предмет грубых ошибок (количество вводимых аналитов, работа с одними пипетманами, проверили ЖХ/МС систему).
Кто сталкивался с подобными чудесами?
Каково может быть объяснение и где искать концы ?

[Dezh]

Картриджи новые?

[eukar]

А как определялась степень извлечения? (Вспоминаю задачу МХО прошлого года - хроматографическое разделение аминокислот и их фотометрическое определение. Одна а/к определялась нормально, для второй определялось около 30%, если сделано не криво, для третьей - около 120%. Это было квалифицировано как особенности методики количественного определения (снимались а/к почти количественно), и максимальный балл школьники получали за величины, попадающие в интервал, определенный при отработке методики.)

[klinerru]

Картриджи новые (заказывали месяц назад, одноразовые естественно).
Извлечение определяли по разнице в количествах стандартов (площади хроматографических пиков, условия обсчета одни и те же) введеных до нанесения пробы на картриджи и введеных в экстракт после элюирования с картриджей. (стараюсь писать понятно, извините, если криво).
Вводимые до и после экстракции количества стандартов одинаковые ( это и их концентрации - первое, что проверили и перепроверили).
Далее следует стадия упаривания полученных экстрактов, перерастворение в подвижной фазе и ВЭЖХ/МС анализ.

[Сержл]

шприц помыли, мож там сидит. Либо гипервкол в колонку, часть засевшего выходит вместь с новой порцией веществ. Попробуйте холостой вкол.

[klinerru]

По зрелому размышлению/опросу коллег в лаборатории возник дополнительный ворос: какое превышение степени извлечения (над 100 %, за которые принимается количество стандартов добавленных в экстракт после картриджей) можно считать разумной ошибкой метода?
Хотелось бы конечно в районе 5% , но, как отметил уважаемый eukar, 130% тоже может быть результатом.
И все-таки любопытно понять природу таких вещей, тем более, что не я первая с ними дело имею.

[klinerru]

Вкалывает автосамплер, промывка и шприца и линии ввода учтена. Холостые делали: между одной и той же пробой, между разными пробами, после вкола смеси стандартов. Везде чисто.

[Dezh]

Интересно, тогда еще вопросы:
Пробовали ли строить калибровку по методу добавки, если да, то как точки ложаться на прямую?
Какие картриджи используете (фирма, марка, емкость)?
В пределах анализа одного образца мочи результаты тоже "плавают"?
Делали тоже самое в холостую на чистой воде?

[Сержл]

130% не дело, погрешность должна быть до 3-5% и это много. По вколу, может погрешность при вводе стандартов очень прыгает. вколите несколько раз стандарт, проверьте себя. Как вариант, может из нового картриджа вылезать какая-нибудь кака.

[klinerru]

1) Смесь стандартов вкалывали. При рассчете стандартных отклонений по площадям хроматографических пиков для 5 стандартов (3 последовательных вкола) отклонение составило 6-11 %
2) Одну и ту же пробу мочи анализировали 3 раза. Отклонения по площадям аналитов составляли 0,05-7,7 % (для добавки в пробу до ТФЭ) и 0,1-6,1 % для стандартов введенных в экстракт после ТФЭ.
3) Метод добавки не пробовали - спасибо за идею. Мы в качестве стандартов используем 2 дейтерированных аналога и 3 недейтерированных вещества. Для последних это может исправить картину, но вот почему дейтерированных после экстракции больше вылазит?

В принципе такие работы делали до нас и проблемы с воспроизводимостью экстракции были у всех (стандартный ответ - сложность матрицы), НО ни в одной публикации большее 100% не видела - поэтому и спрашиваю

[klinerru]

Извините, забыла написать про картриджи:
Strata-x, Phenomenex (обращенно-фазовый полимерный сорбент)
если быть точным: http://www.prochrom.ru/ru/?idp=StrataX

[Dezh]

<Strata-x, Phenomenex (обращенно-фазовый)>

Значит тут проблем быть не должно, сорбент крутой one for all!

<(3 последовательных вкола) отклонение составило 6-11 %>
Таким образом, 111% вы уже можете объяснить сами, это уже ограничение метода и его можно пытаться исправить варьируя условия разделения.
Колонки какие? Есть темостат колонки?

Пробуйте калибровку методом добавки и тфэ стандартов из воды (посмотреть величину влияния матрицы).

[СГР]

Из описания я не понял, делался ли анализ мочи без добавления стандартов. Нужно сделать анализ мочи без добавления стандартов и в ней не должно быть пиков на месте пиков анализируемых веществ. Вы уверены, что ёмкости картриджей хватает для извлечения вводимых количеств станадртов?

[klinerru]

Большое спасибо всем за советы и обсуждение!


Емкости картриджей должно хватать. Находила описание аналогичной работы с этими картриджами, концентрации стандартов там были даже выше.

Анализ мочи без стандартов сделаем обязательно (сейчас ждем новую партию картриджей). И метод добавок точно придется применить.
Пока что получаетсмя, что ошибка наша складывается из
1) влияние компонентов матрицы (моча). По предварительным результатам на месте выхода наших стандартов всегда присутствуют какие-то матричные компоненты, их влияние и пытаемся скомпенсировать дейтерированными стандартами.
2) ошибка расчета площадей (даже при анализе стандартов )


Еще раз большое спасибо! За новые идеи и прояснение (просветление будет впереди )

[Dezh]

Напишите потом как все проверите!!!

[Илья226]

Большое спасибо всем за советы и обсуждение!


Емкости картриджей должно хватать. Находила описание аналогичной работы с этими картриджами, концентрации стандартов там были даже выше.

Анализ мочи без стандартов сделаем обязательно (сейчас ждем новую партию картриджей). И метод добавок точно придется применить.
Пока что получаетсмя, что ошибка наша складывается из
1) влияние компонентов матрицы (моча). По предварительным результатам на месте выхода наших стандартов всегда присутствуют какие-то матричные компоненты, их влияние и пытаемся скомпенсировать дейтерированными стандартами.
2) ошибка расчета площадей (даже при анализе стандартов )


Еще раз большое спасибо! За новые идеи и прояснение (просветление будет впереди )

Два замечание:
-Проверьте стандарты другим методом..стероиды могли и развалиться......а потом калибровку вы провели по стандартам с заниженной концентрацией...вот у вас выход и за 100% перевалил.
-Исключите влияние матрицы. Сделайте модельную смесь...в холостую пробу внесите определенное количество стандарта....и прогоните через патрон. Замерьте выход...он должен быть в пределах 70-90%. Слишком низкий- где то потери, слишком высокий-с патрона лезет какая то гадость которая перекрывает пик вашего стероида. Блиезкие к 100% и выше значения выходов веществ в статьях...это некорректные данные. Патрон в любом случае часть вещества должен сорбировать необратимо...плюс в матрице часть остается.....
-Насколько я понял вы определяете те компоненты чтоо должны содержаться в моче в качестве фоновых веществ? Тогда вопрос- а их содержание что до вас никто не мерил? Хотя бы суммарное? Может быть ваша ошибка в интерпритации получаемых результатов?