белок vs щёлочь

[Любитель_Манниха]

Глупый вопрос: можно ли сказать, что если нечто белоксодержащее, скажем, мясо,
кинули в колбу с избытком раствора щёлочи, погрели полчаса при 50-60 С (допустим, ещё пару суток стояло при комнатной),
и известно, что после процесса в колбе остаточная концентрация NaOH 1-2 моль/л , - то негидролизованного белка в колбе нет?

[SkydiVAR]

Если склероз не подводит - не все пептидные связи гидролизуются щелочью. Но даже в этом случае в растворе будут ди-/три-/тетрапептиды в качестве примеси к смеси солей аминокислот/жирных кислот и фосфорилнуклеотидов. Впрочем - не биохимимк, могу и ошибаться.

[Vanya Ivanov]

вообще то это классический способ очистить кости от всего. А так же - способ варить мыло. Все части животины после обрезки мяса гидролизуется щелочью, а потом в кислоте выделяют высшие жирные кислоты, из котрых делаю мыло!

[Любитель_Манниха]

Мыло не нужно
Кости тоже
В принципе, вопрос в том, можно ли определить отдельно белок, и отдельно аминокислоты
в такой смеси, содержащей также углеводы и соли жирных кислот. (допустим, жирную баранину засыпали сахаром и кинули в щёлочь )
Я пока думаю в такую сторону: сумму аминокислоты+белок определять анализом на общий азот, а аминокислоты извлекать ионным обменом.
Но короткие пептиды ведь тоже будут садиться на смолу?

[Vanya Ivanov]

ионообменник - из пушки по кукушке ....
Надо делять проще и точней. Общий азот по Кьельдалю - 1,5 - 2 ч работы. А определение белка СФ (280 нм, лоури или Бредфорда) - ну сами уж выберете по чему легче калибровать.
В молоке - мясе, азот не белковый (днк-рнк и био амины) пренебрегают там его от 0.1 до 0.05%. Это точность измерения общего азота.
Разница - пересчет - амино-кислот. В принципе в практикумах по пищевой химии и технологии все это должно быть описано. Вроде когда то делал общий азот крови - там (практикум по биохимии для универа) даже какие-то коэффициенты пересчета или уточняющие для разных тканей в т.ч. и для мышечной ткани.

[Любитель_Манниха]

Лоури, из Педивикии:
Метод очень чувствителен к наличию в растворе посторонних восстановителей
Не пойдёт, там прилично восстанавливающих сахаров.

Бредфорд:
inhibited by the presence of detergents
Мыла Отделять жирные кислоты после подкисления

Биуретовый метод в присутствии аминокислот - не подойдёт?

Кстати, сумму аминокислоты+белок м.б. нингидрином определять, после окисления восстанавливающих сахаров
йодом и убирания йода тиосульфатом?

[avor]

----В принципе, вопрос в том, можно ли определить отдельно белок, и отдельно аминокислоты.

C ЭТОГО надо было начинать, описав ссуть да дело и состав и происхождение смеси.

Грюбо - белок из такой смеси замечательно должен высаживаться например трихлоруксуной кислотой или хлорной кислотой, если к такой смеси добавить хлороформ или изооктан, то уйдут и жиры с жирными кислотами, хотя они вроде как должны всплывать в такой смеси и экстрактор для них не так уж и обязателен. Осадок можно растворить в буфере, если будет плохо растворятся, то в буфере с SLS(он же SDS). Супер от осадка можно использовать для определения аминокислот с нингидрином. Белок из осадка можно определить любым способом и Брэдфорд и биуретовым и Лоури и BCA(бицинхониновая кислота) (Брэдфорд, правда с SDS не работает). Восстанавливающие сахара, которых вроде как в кислом осадке практически быть не должно, в методе Лоури и BCA и биурете будут мешать только, если вы будете греть раствор А(с медью) с пробой на кипящей бане, но так никто не делает, поэтому их боятся не надо.

Способ 2
Так же можно нейтрализовать смесь разбавить образующуюся соль и высадить белок ацетоном. Но тут возможны всякие мелкие неприятности с возможным соосаждением соли и аминокислот.

Способ 3
Опять нейтрализовать,потом экстрагировать жир и липиды хлороформом с метанолом, потом водный слой фильтровать на ултьрафильтрационной мембране, типа с отсечкой 1000, 3000, 10000 кДа по вкусу(что считать пептидом и надо ли считать его концентрацию). Желательно избавится от примеси органических растворителей потому что не всякая ультрафильтрационная ммембрана их любит, хотя полисулфоновая - выдержит
На фильтре нужно сделать несколько промывок-концентрирований. Фильтрат собрать на аминокислоты, а "осадок"(концентрированный раствор) - на белок.

Как то так.

[Iskander]

Почитайте про метод Руэмана. Там расписан гидролиз белков. Скажем, 1-2 М щёлочь ему довольно таки пофигу.

Про отдельное определение - я бы советовал механическое измельчение образца, затем микродиализ и определение АК в диализате по Руэману или с ТНБС. Потом, например, сжигание по Кьельдалю или жёсткий гидролиз и определение суммы белковых и растворимых АК.

[Vanya Ivanov]

не придумывайте велосипед читайте - методички пищевых технологий.

[avor]

не придумывайте велосипед читайте - методички пищевых технологий.

Интересно кому это в пищевке может понадобится отделять мух от котлет, тьфу аминокислоты от белков.

[Любитель_Манниха]

Коллеги, спасибо за идеи, продолжайте, я записываю

Исходная масса - отходы производства кормов для кошечек-собачек. 1-2 моль на кг - остаточное содержание щёлочи.

[ Post made via Android ]

[avor]

Исходная масса - отходы производства кормов для кошечек-собачек. 1-2 моль на кг - остаточное содержание щёлочи.

И что дальше?! Цель то какая?

[Polychemist]

Не знаю, надо ли это тут, но стандартный аминокислотный анализ белков предполагает нагрев выше 100С в крепкой солянке (ампула), далее - ионная хроматография.

[Любитель_Манниха]

Исходная масса - отходы производства кормов для кошечек-собачек. 1-2 моль на кг - остаточное содержание щёлочи.

И что дальше?! Цель то какая?

Гидролизат дальше применяется как некий реагент, считается, что действующие вещества - аминокислоты.
Содержание аминокислот может плавать раза в 4 (*). Я считаю, что это в основном из-за непостоянства состава сырья.
Но насяльника думает - а вдруг гидролиз идёт не до конца, потому что таджик с лопатой отлынивал. Вот, пытаюсь разобраться

(*) выяснял их содержание другой человек, как он это делал - я не в знаю, но одним ухам слышал про общий азот,
т.е. полный гидролиз белков принимался за аксиому.

[Iskander]

А чо, гидролизат казеина больше не выпускают? Ультрафильтрацию белковой жижи на 10к тоже отменили? Протеиназа К больше не работает?
Делать "некий реагент" из отходов производства корма для собачек, да ещё не имея методов анализа - это достойно Шнобеля.

А так "лечение по фото" - 1-2М щёлочь белок гидролизует очень долго. В методе Руэмана используется 50% при нагревании градусов до 70. Считается, что процесс идёт часов 10 и то для растворимых белков. Классические рецепты - 3М ПТСК, 4М солянка, 3М NaOH в ампуле на 120-130 градусов 3-4 часа.

[Любитель_Манниха]

А чо, гидролизат казеина больше не выпускают?

Дык его надо покупать, а за приёмку отходов платят.
Углеводы в составе гидролизата тоже якобы играют роль.

Делать "некий реагент" из отходов производства корма для собачек, да ещё не имея методов анализа - это достойно Шнобеля.

Это бизнес, бессмысленный и беспощадный
Но вроде начинающий исправляться

[avor]

В таком раскладе просто измеряйте первичноаминный азот нингидрином до гидролиза и после и уже будет показательно по части глубины прохождения гидролиза, в отичии от общего азота. Что касается технологии, то ферментные методы гидролиза наверное тоже иеют право на существование, но только конечно не протеиназой К, а то это будет оооочень дорогой гидролизат.

[Iskander]

Ну, субтилизином, неочищенным экстрактом с протеиназой К, тем же трипсином, наконец.
Всё зависит от того, что за реагент выпускается и для чего.

Мы делаем что-то похожее из картофельного сока ультрафильтрацией. Получается "аминокислотный концентрат".

[Любитель_Манниха]

Хм. Попробовал добавлять трихлоруксусную кислоту.
Если видимого помутнения нет, значит ли, что нет и значимых количеств белка?
Почитал статью о депротеинизации экстрактов мясца, о мутности ничего не сказано,
только - смешали равные объёмы экстракта и 5%-ной кислоты-осадителя, подождали полчаса и центрифугировали
на 10 тыс g 15 минут.

[avor]

У вас не стандартный экстракт, а щелочной. ТХУК пока рН нейтральные не высаживает белок, а наоборот растворяет. В приводимой вами статье все экстракты были либо кислые, либо нейтральные. Тк у вас щелочной экстракт нужно добавлять больше кислоты.