Несколько уточнений Dry Column Vacuum Chromatography (DCVC)

[Asb]

Дорогие коллеги, органики!

Мой вопрос про метод разделения на сухой колонке.
Есть замечательный мануал http://www.pittelkow.kiku.dk/synmet/synmet2012/DCVC.pdf
и видео [youtube]https://www.youtube.com/watch?v=lBNhu4kJ4Mc[/youtube]

В статье пишут про эмпирическое правило, что на 1 см2 сечения колонки в целом рекомендуется 500 мг разделяемой смеси. Таким образом в теории, колонка с диаметром 4 см должна вмешать около 6 г смеси. Конечно учитывая типичное соотношение массы образца к массе стационарной фазы которое как правило находится в пределах от 1:20 до 1:100 - это может быть плюс минус километр.
МЫ столкнулись с проблемой. У нас не самая сложная смесь три компонента с Rf=0.1, 0.47 и 0.7 (70% этилацетат в гексане). Целевое соединение с Rf=0.47. Масса смеси 4 г, силикагель 300-400 mesh, колонка 4 см в диаметре, высота слоя 5.5 см. Градиент 0-80%, объем фракции 30 мл. И мы увы потерпели фиаско, загрузка вещества явно великовата.

Отсюда мой вопрос коллеги, поделитесь опытом из практики. Как Вы для себя решаете вопрос о диаметре колонки в зависимости от массы разделяемой смеси.

Заранее большое спасибо за ваши ценные советы.

[Nickolas]

А сколько силикагеля было в граммах? Сколько фракции всего вы собрали по 30 мл (0-80% EtOAc)? Когда произошло элюирование компонентов? Как загружали разделяемую смесь?
Сечение и диаметр - дело десятое. Главное чтобы она не была слишком узкой и длинной. Важно количество силики, как ее набили, как загрузили смесь и правильность выбора градиента..
Я обычно беру для несложных смесей 20 г. силики на грамм разделяемой смеси. Собрав 5 фракций, сразу параллельно делаю ТСХ и если искомое вещество появилось, состав элюента больше не меняю.

[Asb]

Nickolas спасибо за Ваш оперативный ответ. Мы делали в соотвествии с рекомендациями мануала. У нас в колонку при рекомендуемой высоте слоя (в мануале говорится что он всегда постоянен и находится в пределах 4-7 см) и вакуумной утрамбовке помещается 25-26 г силикагеля. Исходя из рекомендации градиент мы не останавливаем до полного выхода искомого соединения. В нашем случае выход начался с 5 фракции, но с 6 уже шло два пятна 0.47 и 0.7. Всего было 10 фракций, шаг увелечение объема этилацетата 10% процентов. В мануале отмечается, что остановка градиента приводит к сильной потери разрешения.

Относительно сечения и диаметра. Получается, что в колонку диаметром 4 см - вмещается 25 г силикагеля, 6 см - 56.53 г, 10 см - 157 г. На последнем количестве по вашей рекомендации можно делить около 6 г соединения. Авторы же в своей оригинальной работе в Synthesis 10.1055/s-2001-18722 на колонке с диаметром 10 длина 5 делят 10 г сложной смеси.

Скажите, пожалуйста, а на ваше количество силикагеля (25 г) какой объем одной Вашей фракции?

[Nickolas]

Навскидку: у вас очень крутой градиент и мало фракций. У меня обычно получается 20-30 фракций.
Проще начать с более пологого градиента и после выхода двух продуктов можно уже и увеличить концентрацию этилацетата.
Колонку можно сушить и в это время делать ТСХ, чтобы принять дальнейшее решение по градиенту. Такая остановка, как правило, не сильно влияет на разделение, так как колонка частично сушится:

Because the column gets sucked dry between fractions you can easily do other stuff whilst running it. Even leaving it for a few hours will not ruin the resolution.

http://curlyarrow.blogspot.com/2006/10/ ... raphy.html

В мануале отмечается, что остановка градиента приводит к сильной потери разрешения.

Обычно я останавливаю градиент после появление искомого продукта, так как если этого не делать, то быстро начинают выходить примеси, которые следуют за ним. Разрешение разделения после моего продукта меня уже не интересует.

Скажите, пожалуйста, а на ваше количество силикагеля (25 г) какой объем одной Вашей фракции?

Обычно 20 мл.

[Asb]

Nickolas, еще раз спасибо за Ваши ценные советы. Вы практикуете колонки DCVC со слоем силики выше 5-7 см?

[lexeym]

А почему именно сухая колонка использовалась?

[Asb]

У этого метода множество плюсов, относительно классического флэша. Чтобы не повторяются, это хорошо описано в статье, ссылка выше.

[Jokermaniak]

У вас силика крупнее чем у авторов. У них 15-40 мкм, тобишь 400-800 меш, это уже больше для преп-ТСХ или машинной хроматографии. Кстати, это одна из причин, почему слой короткий - с такой силикой обычные 15-20 см хрен продавишь вручную или вакуумом. Я такой пихаю на флеш-хроматограф в колонки с ДАК, 40 см слой сопротивляется на 6-10 бар. Отсюда у авторов и загрузки больше, и выше эффективность разделения.

По поводу самого процесса: надо собирать фракции не больше 0.2 CV, а лучше 0.15 или даже 0.1. У вас ~140 мл объем рабочей зоны, пористость у обычной силики ~0.7, то есть СV около 100 мл. Фракции по 30 мл это 0.3 CV, это слишком грубое фракционирование. Градиент должен быть не линейный, а экспоненциальный (на самом деле ещё сложнее, но примерно экспоненциальный, особенно на начальном участке). Тут всегда немного магии, с опытом приходит умение подбирать оптимальный градиент. А я вот уже его подрастерял за последнее время(

20 г силики на 1 г смеси - это минимум, его пишут во всяких учебниках. Работает для не особо сложных смесей обычной органики. Если у вас пятна 0.47 (ИМХО для Rf такая точность не имеет физического смысла) и 0.7 - для такой смеси уже желательно брать 30-40 г силики на грамм смеси. Есть классы веществ которые люто грузят силику. В основном склонные к агрегации, всякие там комплексы, порфирины и полиароматика. Там и 100 сорбента на 1 г бывает недостаточно. Надо знать своего клиента)

По своему опыту могу сказать, что хроматография - слишком сложный и многофакторный процесс, чтобы какой-то мануал на 2 страницы смог предложить универсальное решение. Я много делал колонок с окрашенными веществами, и видел некоторое дерьмо. Там порой такой карнавал творится, который ни в какие ворота не лезет. Пятна обгоняют друг друга, сливаются вместе, расползаются, приобретают конусовидную форму, разрываются посреди колонки и так далее. А большая часть мануалов и учебников пишется из предположения, что скорость пятна пропорциональна скорости элюента и его элюирующей силе.

Конкретно я к DCVC отношусь скептически. Это довольно узкая история, не имеющая принципиальных преимуществ, которую авторы пытаются представить как какой-то общий метод. Ну и верификация у них, мягко говоря, так себе.

[Asb]

Jokermaniakб Спасибо за Ваш развернутый ответ.

[Phobos]

Я не особо верю в рассказы про чудодейственные свойства сухой колонки, допускаю, что для некоторых смесей на ней вдруг получится лучше разделение из-за меньшего размазывания, но как общую рекомендацию всегда работать именно так - не воспринимаю.
Массу силики беру всегда на глаз, как-то оно уже в прошивке мозговой сидит, интуиция не подводит. Начинаю разделение трех точек с такого элуэнта, чтоб на ТСХ с ним средняя сидела на бейслайне и не двигалась, а верхняя была где-то на Rf = 0.2-0.3. Вышла верхняя - поднимаю полярность так, чтоб средняя на ТСХ передвинулась на 0.2-0.3, а нижняя оставалась неподвижной. Выйдет средняя - потом так же вытаскиваю нижнюю.
Еще я тут как-то делился впечатлениями от работы с циклогексаном и хлороформом вместо гексана-этилацетата. Колонка получается прозрачная, и движение всех фракций видно невооруженным глазом.

[Nickolas]

Еще я тут как-то делился впечатлениями от работы с циклогексаном и хлороформом вместо гексана-этилацетата. Колонка получается прозрачная, и движение всех фракций видно невооруженным глазом.

Очень интересно. Неокрашенные тоже как-то видно? И почему именно циклогексан, а не гексан?

[Phobos]

Циклогексан и хлороформ имеют близкие к силике показатели преломления. Гексан - сильно отличается. Да, движение неокрашенных фракций видно в виде мутной полосы.

[Nickolas]

Спасибо, Phobos! Обязательно попробую на силике для DCVC и отпишусь.

[yuras]

Сочетание хлороформ/метанол либо этанол подобного эффекта ведь не дае́т?

[Jokermaniak]

Нет. Бензол дает ещё.

[yuras]

Я к тому, что для более полярных смесей, где элюенты типа метилен/метанол похожих сочетаний нет?

[yuras]

Я не особо верю в рассказы про чудодейственные свойства сухой колонки, допускаю, что для некоторых смесей на ней вдруг получится лучше разделение из-за меньшего размазывания, но как общую рекомендацию всегда работать именно так - не воспринимаю.
Массу силики беру всегда на глаз, как-то оно уже в прошивке мозговой сидит, интуиция не подводит. Начинаю разделение трех точек с такого элуэнта, чтоб на ТСХ с ним средняя сидела на бейслайне и не двигалась, а верхняя была где-то на Rf = 0.2-0.3. Вышла верхняя - поднимаю полярность так, чтоб средняя на ТСХ передвинулась на 0.2-0.3, а нижняя оставалась неподвижной. Выйдет средняя - потом так же вытаскиваю нижнюю.
Еще я тут как-то делился впечатлениями от работы с циклогексаном и хлороформом вместо гексана-этилацетата. Колонка получается прозрачная, и движение всех фракций видно невооруженным глазом.

Да и как с ней всегда работать, если есть килотонна чувствительных веществ, которые от такого кислородного окормления будут прямым рейсом отправляться в свой химический рай?)

[yuras]

Нет. Бензол дает ещё.

Так тогда и метилен с диоксаном, а также толуол и ксилолы такой же эффект давать должны)

[Phobos]

ДХМ сам по себе нехороший растворитель для колонки, потому что при движении вещества по нему вполне может возникнуть локальная экзотерма, которая приведет к разрыву слоя силики. Хлороформ с несколькими процентами метанола еще сохраняет прозрачность. С диоксаном не пробовал.

[yuras]

ДХМ сам по себе нехороший растворитель для колонки, потому что при движении вещества по нему вполне может возникнуть локальная экзотерма, которая приведет к разрыву слоя силики. Хлороформ с несколькими процентами метанола еще сохраняет прозрачность. С диоксаном не пробовал.

Экзотерма да, бывает. Но любопытно, что эффект прозрачности от хлороформа наблюдал, а вот от метилена не припоминаю, хотя показатели почти идентичны. Зернистость силикагеля ведь влиять не должна?