Помогите рзобраться с синтезом сорбента "АЕ-Агароза&quo

[Алексей Соколов]

Помогите разобраться с методикой синтеза сорбента АЕ-Агароза. Несколько раз пытался синтезировать согласно статье Musci, G., Bonaccorsi di Patti, M.C., Fagiolo, U., Calabrese, L. Age-related changes in human ceruloplasmin. Evidence for oxidative modifications. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 13388-13395. Получилось раза 3 из 10, а хотелось бы добиться воспроизводимости.
"Sepharose was derivatized
by a modified protocol of a published procedure (Calabrese et al.,
1988). 100 ml of the resin was suspended in 70 ml of 5 N NaOH under
constant stirring in an ice bath, and 7 ml of epichlorohydrine followed
by 0.5 g of NaBH, were added. The mixture was then incubated for
1 h at 40 "C and for 2 h at 60 "C. The resin was subsequently washed
on a Buchner funnel with water until the pH reached neutrality and
was then resuspended in 70 ml of 2 N NaOH containing 0.25 g of
NaBH.. The suspension was either heated at 95 "C for 45 min or
subjected to three boiling-cooling cycles, then sequentially washed
with 1 liter of 1 N NaOH containing 5 g of NaBH, and water until
the pH reached neutrality. Excess borohydride was then removed by
washing with 500 ml of diluted acetic acid (pH 3-4) followed by water
to restore neutral pH. 100 ml of activated Sepharose was suspended
in 70 ml of 10 N NaOH under constant stirring at 60 "C, and 100 ml
of 100% (w/v) chloroethylamine was slowly added. At this stage, care
was taken to keep the pH high (10-12) during the coupling reaction
by the addition of 10 N NaOH. The resin was then incubated for 2 h
at 70 'C, washed with water to remove unreacted material and to
lower the pH to neutrality, and finally suspended in buffer, ready for
use. Each batch of derivatized Sepharose was stored at 4 "C and
sterilized with 0.1 N NaOH before use."

Насколько я понял сначала Сефарозу сшивают эпихлогидрином, чтобы она выдержала нагревание с хлорэтиламином в щелочи. Потому что в ранних статьях данного коллектива был описан метод синтеза простым нагреванием Сефарозы в 10 М NaOH с хлорэтиламином, у меня это приводило к расплавлению гранул смолы и образованию геля не пригодного как для хроматографии. Весь синтез до добавления хлорэтиламина идет, дейсвительно получаются гранулы, которые выдерживают нагревание в 10 М NaOH, в отличие от Сефарозы.
Но на этапе добавления хлорэтиламина начинается путаница:
По-моему, хлорэтиламин в щелочи должен дать этиленимин и речи о пришивке аминоэтильной группы к смоле уже не идет, к тому же при 70 0С этиленимин улетает из раствора - всегда при синтезе есть запах аммиака.
Может быть моя шибка в том, что у меня гидрохлорид хлорэтиламина, который я добавляю к смоле в растворе 10 М NaOH, но рН я потом все равно подвожу до 10-12.
У меня есть подозрение, что должна идти полимеризация этиленимина и возможно сополимеризация с сорбнтом. Поскольку коммерческая аминоэтил-Сефароза не обладает описанными свойствами, а полиэтиленимин-целлюлоза весьма похожа, но уж больно неудона в работе.
Пожалуйста, помогите в этом разобраться. Подскажите, какими модификациями можно добиться эффективной сополмеризации Сефарозы с этиленимином.

[Максим]

Помогу ли - не знаю, но поучаствовать - поучаствую.
Во-первых, в статье не указано, какая же именно сефароза была использована, потому как сефароз бывает много: просто сефароза (несшитые шарики агарозы), сшитая сефароза (с маркой CL - cross-linked), бывает разной процентности: 4B - 4% агарозы, 6B - 6% агарозы. Может быть Вы брали разные марки сефарозы, поэтому у Вас получались разные результаты. Если взять несшитую сефарозу, то нагревание ее, по-моему, выше 60 или 70 градусов вызовет ее плавление, тогда как сшитая не будет плавиться. Тем не менее, видимо по статье брали простую несшитую сефарозу, делали из нее сшитую и затем превращали в АЕ.
Активация. Любят они эпихлоргидрином активировать... Когда в щелочную суспензию агарозы налить эпихлоргидрина, то последний упадет на дно и конечно же не растворится. Поэтому здесь важно весьма интенсивное перемешивание. НО: ни в коем случае нельзя перемешивать обычной магнитной мешалкой: когда якорь трется по дну стакана или колбы, то он перетирает сформованные шарики сефарозы (сефароза - мягкий материал) и вместо геля, состоящего из шариков определенной формы, Вы получаете кашу неизвестного состава. Поэтому перемешивать надо либо механической мешалкой, либо специальным якорем (на стойках), который не касается дна колбы. Как видно, сначала инкубируют при 40 градусах (при этой температуре начинается сшивание, но сефароза еще не плавится), далее температуру повышают до 60 - при этом реакция идет быстрее, а сефароза уже расплавиться не может, поскольку уже слегка подшита. Фильтрация. Сефарозу далее фильтруют и говорят, что надо мыть водой. Возможно, для более полного удаления непрореагировавшего эпихлоргидрина следует промыть сначала какими-нибудь 10 объемами воды, затем вода/диоксан=10:1, затем вода/диоксан=5:1, вода/диоксан=1:1, вода/диоксан=1:5, вода/диоксан=1:10, диоксан, затем в обратном порядке. Такую процедуру часто используют, если хотят сменить растворитель с водного на неводный. Надо ли это делать в Вашем случае - это повод для спекуляций и дискуссии - лично я не знаю. Кипячение с натрийборгидридом. Не весь эпихлоргидрин израсходуется на сшивание шариков сефарозы. Большая его часть просто пришьется к сефарозе и на поверхности выскочат эпоксидные группы - это стандартный метод активации сефарозы. Далее авторы кипятят с натрийборгидридом - если мне не изменяет память, то это вот для чего: агароза - это природный полисахарид и он среди прочих содержит сульфогруппы, которые придают сорбенту отрицательный заряд, тем самым превращая сорбент в катионообменник, при этом неспецифическая сорбция белков возрастает. При кипячении с натрийборгидридом неспецифика падает, что означает, что сульфогруппы куда-то исчезают. Но при кипячении с натрийборгидридом в щелочных условиях часть эпоксидных групп на сефарозе раскроется, поэтому be carefull. Далее следует стадия пришивки хлорэтиламина. Что такое "100 ml of 100% (w/v)" для меня загадка. Но если бы у меня под рукой был гидрохлорид (или сульфат) хлорэтиламина, то я бы конечно использовал его (кстати, по-моему живого хлорэтиламина и не существует вовсе - он в азиридин сразу схлопывается. А нюхать реакционную смесь с азиридином... я бы не нюхал и Вам не советую). Так вот, при добавлении хлорэтиламина может происходить разное: часть его может сначала схлопнуться в азиридин, который начнет алкилировать всякие гидроксильные группы, при этом выскочит аминогруппа, которая будет реагировать с хлорэтиламином или тем же азиридином. С другой стороны, хлорэтиламин своей аминогруппой будет со свистом раскрывать эпоксид, при этом будет выскакивать хлор, который будет легко реагировать с другой молекулой хлорэтиламина и т.д. Т.о. получится привитой сополимер полиэтиленимина к сефарозе. Скорее всего прививка будет идти по второму механизму, поскольку иначе в качестве исходной брали бы коммерчески доступную сшитую сефарозу Sepharose CL-4B или Sepharose CL-6B. Посему заключаю, что скорее всего у Вас проблемы не на второй стадии, а на первой - активации сефарозы эпихлоргидрином. Если Вам надо получить сорбент одинакового состава и одинаковыми свойствами, то надо наверное контролировать активацию сефарозы эпихлоргидрином. Например, сшили Вы сефарозу ЭХГ, затем отмыли образец водой-диоксаном, посушили в вакууме и записали ИК-спектр. Возможно удастся выловить пик эпоксидного кольца (хотя я не уверен). Тогда, если удастся, то установить количество эпоксидов не составит труда. Тогда можно будет установить, как количество эпоксидов влияет на полученный сорбент.
Для размышления: зачем делать прививку полимера на поверхность, если на поверхность можно привить сразу полимер... Например, берете активированную эпихлоргидрином или дивинилсульфоном сефарозу и льете на нее полиэтиленимина, инкубируете сколько-нибудь времени и получаете привитый полимер - ту же АЕ-сефарозу. Или берете сефарозу (можно и несшитую), заливаете ее периодатом натрия, инкубируете, отмываете и получаете сефарозу с альдегидными группами. К такой сефарозе добавляете полиэтиленимин и цианборгидрид, инкубируете, отмываете, получаете. Или берете карбоксиметилсефарозу, льете на нее полиэтиленимин, водорастворимый карбодиимид (EDC, например), инкубиируете, отмываете, получаете... Много всякого можно придумать.
Ну в общем, успехов! Поделитесь пожалуйста рабочей методикой, если удастся довести процесс до воспроизводимости.

[Алексей Соколов]

Максим, большое спсибо за такой содержательный ответ.

"в статье не указано, какая же именно сефароза была использована"
В статье использовали Sepharose 4B в более ранних указана 6B, я брал и тот и другой вариант, изменялась только "легкость" полученных гранул. В более ранних статьях про эпихлоргидрин вообще ничего не было сказано, и естественно при нагревании сефарозы в щелочи с хлорэтиламином мы вовсе получали после охлаждения гель, который, если его хорошенько растереть и отмыть, весьма прилично связывал белок, но главным образом на поверхности.

"Когда в щелочную суспензию агарозы налить эпихлоргидрина, то последний упадет на дно и конечно же не растворится. Поэтому здесь важно весьма интенсивное перемешивание."
Тут Вы абсолютн правы, эпихлоргидрин оказывался на дне, потом, когда я интенсивно перемешивал суспензию стеклянной палочкой он расходился на мелкие шарики, и если прекратить перемешивание опять собирался на дне. Но если мешать интенсивно около часа, то он равномерно расходился по суспензии и уже не выпадал на дно. Отмывался эпихлоргидрин достаточно легко, уже после 10 объемов смолы следов в элюате не было.

"Но при кипячении с натрийборгидридом в щелочных условиях часть эпоксидных групп на сефарозе раскроется, поэтому be carefull."
У меня сложилось впечатление, что авторы в принципе не активирую сефарозу эпихлоргидрином, а только сшивают. Хотя утверждать не могу, но уж очень много боргидрида они используют при синтезе. И в принципе метод очень похож на описанный в Дин. "Аффинная хроматография" Мир, 1988, метод получения поперечно-сшитой сефарозы. Там опять таки используется избыток боргидрида для удаления карбоксилатных групп.
У сорбента есть очень неприятное свойство: при пропускании через него крови (на нем мы выделяем белок плазмы крови) она то и дело сворачивается даже при добавление безумного избытка антикоагулянтов. Объяснить это можно только некоторым отрицательным зарядом сорбента, поскольку такие же свойство показаны для кварцевого песка и стекла.

"Далее следует стадия пришивки хлорэтиламина. Что такое "100 ml of 100% (w/v)" для меня загадка. Но если бы у меня под рукой был гидрохлорид (или сульфат) хлорэтиламина, то я бы конечно использовал его (кстати, по-моему живого хлорэтиламина и не существует вовсе - он в азиридин сразу схлопывается."
Да, для меня это тоже необъяснимая вещь. Под рукой только гидрохлорид, я пробовал добавлять к нему ровно один эквивалент щелочи, но при это часть все равно переходит этиленимин.

Вообще я года три назад читал отечественную старую книгу "Полиэтиленимин" в ней утверждалось, что в щелочных условиях полимериация этиленимина идет с большим трудом. Но есть катализаторы: среди них был эпихлоргидрин (!) и дихлорэтан. В один из синтезов я попробовал добавить дихлорэтан (буквально капельку) перед окончанием синтеза. Произошло сильнейшее разогревание смеси, она чуть ли не вскипела. Смола некоторое время вязала белок, но раз от раза все хуже и хуже. Может быть это вымывался со временем полиэтиленимин.
Я попытался просто получить твердый полиэтиленимин. Нужно сказать, что белок он свяывал очень эффективно, но по хроматографическим свойствам никуда не годился.

Спасибо за рекомендации по пришивке полиэтиленимина к сорбентам, обязательно попробую и поделюсь результатами. ИК-спектр мне, к сожалению, не доступен. Если у Вас есть какие-либо советы по поводу эффективного получения недлинного полиэтиленимина, напишите, пожалуйста.

[Максим]

Где же взять низкомолекулярный полиэтиленимин... Как же его синтезировать... Это вопрос... Я бы из банки взял, на которой написано PEI (low molecular mass) :) Просто есть некоторый набор продуктов, которые легче купить, нежели синтезировать - обойдется меньшей кровью. То же с самой АЕ-сефарозой - ее лучше купить и ставить выделение на ней, нежели мучиться с ее деланием (ну, конечно, если только коммерческая сефароза устраивает).
По поводу же синтеза, сначала я тоже подумал, что натрийборгидрид нужен для удаления всяких карбоксилов, сульфонатов и эпоксидов с сефарозы. Но потом меня смутила фраза "100 ml of ACTIVATED sepharose..." Дело в том, что просто сшитую сефарозу активированной не называют, а если людям надо модифицировать сшитую сефарозу, то для модификации берут сефарозу марок CL - она так же доступна, как и обычная сефароза.
А с эпихлоргидрином - не поленитесь - поставьте механическую мешалку и установите постоянное сильное перемешивание - не пожалеете.
На счет крови - я не крупный специалист, но если вам нужны белки плазмы крови, то зачем вкалывать цельную кровь? Отфугуйте клеточки, а сыворотку вколите, она ж не свернется, правда? А что вы вообще выделяете, какие белки, а то я вот тоже начал работать с выделением белков из сыворотки крови, но на другой сефарозе.
Кстати, на свертываемость крови влияет только отрицательный заряд или вообще заряд? Потому как полиэтиленимин в физиологических условиях имеет невялый положительный заряд.
Можно, в общем то помодифицировать еще один сорбент - сефадекс. Он часто используется для гель-проникающей хроматокрафии и имеет тоже полисахаридную природу, но в отличие от сефарозы, где полисахаридом является агароза, в сефадексе это декстран. Насколько я знаю, сефадекс электронейтрален и его можно модифицировать так же, как и сефарозу.
Можно еще взять готовый носитель LCAA-CPG (long chain aminoalkyl control pore glass). Это стеклянные шарики с различным размером пор от 100 до 2000 ангстрем, на которых навешаны аминогруппы. Загрузка аминогрупп CPG-500A составляет обычно 100 мкмоль/г. Если этой загрузки мало, то можно полить носитель полиглутаровым альдегидом, а затем полиэтиленимином с цианборгидридом.
Кстати, советую поискать синтез полиэтиленимина в патентной базе данных www.uspto.gov/patft/index.html
Вот, на вскидку, оттуда выдержки:
US 4,614,762
100 parts of commercially obtained 2-methyl-2-oxazoline were introduced to 550 parts of chlorobenzene. 1.6 parts of BF.sub.3 etherate were then introduced. The solution was refluxed for 8 hours. Fine particles formed were dispersed in the chlorobenzene. The material was dried in a vacuum oven at 70.degree. C. and 150 Torr for 24 hours to give 107 parts of yellow powder polyacetylethylenimine.

57 parts of the formed polyacetylethylenimine and 98 parts of 6N HCl were heated to reflux for 6 hours and then treated with 65 parts of NaOH in 400 ml of water (pH=11). The material was then filtered, washed with distilled water and dried. The dried material was extracted with methanol thereby separating any sodium chloride, sodium hydroxide and/or sodium acetate from the polymer. The methanol solution was dried yielding 21.7 parts (80 percent) linear polyethyleneimine. Analysis of the polymer showed it to be over 95 percent hydrolyzed, have water solubility of only 0.06 part/100 part water at 25.degree. C. and have a melting point of 60.degree.-62.degree. C.

Там еще много интересного про polyethyleneimine написано. В общем, успехов!

[Алексей Соколов]

Спасибо за комментарий. Я выделяю из плазмы крови церулоплазмин - это медь-содержащий белок плазмы крови, он с легкостью деградирует под действием протеаз, в том числе протеаз системы свертывания крови. Поэтому выделять этот белок нужно очень быстро, желательно в один этап. До сих пор предложено только два аффинных сорбента: АЕ-Агароза (которая собственно не идентична коммерческой АЕ-Агарозе, а ее синтез как раз описан группой итальянских исследователей и собственно кроме них похоже только мы и пытались повтрить ее синтез, более никто церулоплазмин на ней не выделял, кроме того я в принципе не уверен, что сорбенты у нас и у них одинаковые, потому что условиях сорбции и десорбции белка у нас чуть-чуть отличаются, а вот эффект сворачивания плазмы на сорбенте наблюдали и мы и они). Второй сорбент был предложен мною - Протамин-Сефароза (но несмотря на то, что я даже опубликовал по этому делу статью в 2005 году,в итоге признаюсь, что есть ряд недостатков: протамин частично расщепяется протеиназами крови и его фрагменты остаются на выделенном белке, кроме того, если пришить к смоле слишком много протамина, то белок вообще не элюируется с сорбента).
А вчера я нашел абстракт еще одной статьи на эту тему:
Stern RV, Caffrey JM, Frieden E. A tentacle gel simplifies the purification of ceruloplasmin. Biochem Int. 1992 Jul;27(2):281-9.
The mechanism of how chloroethylamine-treated agarose greatly simplifies the purification of ceruloplasmin (Cp) by preferentially binding this protein from blood plasma has been investigated. Chloroethylamine readily cyclizes to ethylenimine under alkaline conditions which then polymerizes to polyethylenimine (PEI). Ethylenimine and PEI were detected in the reaction mixture used to generate the resin. PEI polymers are grown from the matrix and form "tentacle" ligands, while PEI-silica and PEI-cellulose which are not tentacle gels did not bind Cp as readily. Spermine and spermidine, naturally occurring polyamine compounds, were attached to CNBr activated-agarose and showed weak affinity for Cp. [It should be noted that ethylenimine is a potential human carcinogen and presents an inhalation hazard.]
Это сообщение меня вовсе поставило в тупик, что же получается: если полимеризация начинается на сорбенте, то лиганд лучше, чем чистый ПЭИ пришитый к стеклу или целлюлозе?
Спасибо за ссылку, видимо нужно искать оригинальную статью 1992 года или способы наращивания цепи ПЭИ от сорбента.

[Максим]

Да, видать и действительно особый сорбент таким образом получается... Ну, мне больше сказать нечего, поэтому вам остается экспериментировать. К некоторым статьям у меня есть доступ, поэтому если что надо - пишите на m_kvach@mail.ru - возможно что-то удастся вам выслать.
Да, вот еще, скорее всего вы это видели, но на всякий случай вот еще одна ссылка из патентной базы данных: US 6,783,775 (http://patft.uspto.gov/netacgi/nph-Pars ... PN/6783775) - там как раз используют этот самый сорбент для выделения церулоплазмина.