Помогите со спектрофотометром, пожалуйста!

[Nathalie]

Добрый день всем. Вы - моя последняя надежда.
В лабораторию купили УФ-спектрофотометр. Производитель: Промэколаб, модель: ПЭ-5400УФ. Руководители велели самостоятельно разобраться в устройстве и провести необходимые анализы (опыта работы с данным прибором ни у кого из нас нет). Анализируемое вещество - лидокаин (чистый, не гидрохлорид).По всем правилам, насколько я поняла, почитав литературу, мне необходимо найти длину волны в УФ области, на которой наблюдается максимум поглощения. Причем оптическая плотность (А) желательно должна находиться в диапазоне 0,2-0,8 (читала в госфармакопее), а в идеале: 0,434 (литературные источники). И на этой самой длине волны (где наблюдается пик максимума и А примерно равно 0,4) проводить дальнейшие исследования (количественные - на определение неизвестных концентраций).
Так вот, я включаю УФ-спектрофотометр, ставлю в качестве нулевого образца этанол, в качестве анализируемого - 3% раствор лидокаина в этаноле. Прибор выдает мне, странную (на мой взгляд) спектральную картину (на рисунке, треугольники - это пики максимумов).
Пробовала разные концентрации. От 3% до 12%. Всё одно и то же. Пожалуйста, очень вас прошу, подскажите, что я неправильно делаю? Какую длину волны необходимо взять? Ведь на максимумах оптическая плотность от 2 до 3. А это ни в какие рамки, насколько я понимаю.
Заранее огромное спасибо за любую помощь, рекомендации и отклики

[Любитель_Манниха]

Так у вас зашкал, слишком высокая оптическая плотность, т.к. слишком много вещества. Разбавляйте лидокаин.

[Deminolog]

Поддержу... Причем разбавлять надо не в 2-3 раза. Я бы сначала 0.1% сделал

[talgar]

Да, зашкал виден. А ещё, мне кажется, у вас есть путаница с понятиями "оптическая плотность" и "коэффициент поглощения". Рекомендация работать в диапазоне 0,2-0,8 относится, скорее всего к коэфициенту поглощения, который теоретически может меняться от 0 до 1. Такая рекомендация является мерой снижения экспериментальной ошибки (к краям диапазона ошибка увеличивается) и относится к выбору многих измерительных шкал, даже для манометров.

[Nathalie]

Спасибо огромнейшее за советы. Не могу выразить, как я вам всем благодарна. Спасибо, всё переделаю

[marat]

Я бы начал со спектра чистого этанола.

[Nathalie]

А ещё, мне кажется, у вас есть путаница с понятиями "оптическая плотность" и "коэффициент поглощения". Рекомендация работать в диапазоне 0,2-0,8 относится, скорее всего к коэффициенту поглощения, который теоретически может меняться от 0 до 1.

Извините, пожалуйста, что вновь беспокою. Вот фото выдержек по данной теме.

Здесь же речь идет об оптической плотности. Или я чего-то не совсем понимаю. Объясните, пожалуйста, если у Вас есть возможность, это ведь А должна быть в данном диапазоне?

[chaus]

Требования "меньше 0.2" и "от 0.2 до 0.8" противоречат друг другу. Видимо, во втором случае речь идёт о коэффициенте пропускания.
Насчёт 0.434 -- улыбнуло! Конечно, это lg(e), но почему должен доставлять минимум погрешности?

[amik]

Требования "меньше 0.2" и "от 0.2 до 0.8" противоречат друг другу. Видимо, во втором случае речь идёт о коэффициенте пропускания.

Меньше 0,2 относится либо к холостой пробе,что скорее всего имеется в виду по тексту, либо опечатка, что менее вероятно.
Обратите внимание на " оптическую плотность кюветы с растворителем" - здесь нет слов про анализируемый раствор.

Насчёт 0.434 -- улыбнуло! Конечно, это lg(e), но почему должен доставлять минимум погрешности?

Это из теории фотометрии с учётом оценки погрешности определения. Всё верно.

[talgar]

Nathali, а какого года руководство, на которое вы ссылаетесь? Оно привязано к конкретному прибору? Дело в том, что ваш прибор снимает оптические плотности до 3. Т.е. для вашего прибора идеальным рабочим диапазоном будет оптическая плотность примерно от 0,8 до 2.

[amik]

Коллега talgar , это Фармакопея Российской Федерации, нормативный документ, прописанные методики из которой не имеют право нарушать отдельные организации и их сотрудники.
Про оптическую плотность и её линейность написано многое. Мы сами иногда снимаем вне утверждённого диапазона и пользуемся полученными цифрами, но исключительно для решения внутренних задач. Такие определения не могут являться достоверными и любой контролирующий орган не просто отвергнет представленные цифры, но и, если хватит свободных аудиторов, пришлёт такую комиссию, что мало никому не покажется.

[Nathalie]

Nathali, а какого года руководство, на которое вы ссылаетесь? Оно привязано к конкретному прибору?

К моему прибору не привязано. То были Госфармакопея РФ XII 2007 год, и методичка с кафедры фарм.химии 2015 года.
И вот ещё учебник:


Подскажите, пожалуйста, я правильно понимаю: для того, чтобы найти длину волны с максимумом, в которой погрешность измерений будет минимальна, мне необходимо получить вот эту величину концентрации:

[chaus]

Ну не совсем так. Вы пишете обзорный спектр при (произвольной, но известной) достаточно малой концентрации (настолько малой, чтобы прибор не шкалил и максимум А был от 0.2--0.7 -- это из приведённого учебника). Находите максимум спектра, он даст вам длину волны Л и некоторую оптическую плотность А. По известной взятой концентрации С, длине кюветы l и полученной величине А рассчитываете коэффициент Е в формуле. (Обычно берут несколько пробных растворов с известными концентрациями C, для каждого измеряют А и строят график А=f(C), наклон которого и даёт Е.) А потом, определив Е (или имея график), настроив прибор на длину волны Л, определяете искомую концентрацию в исследуемом растворе.

Но это всё по рабоче-крестьянски, а спецы-аналитики могут дать профессиональные уточнения.

[Nathalie]

Ну не совсем так.

Спасибо Вам огромнейшее!

То есть мой алгоритм действий будет следующим:
1. Кювету №1 с чистым растворителем (этанолом) прогоняю в качестве нулевого образца.
2. Смешиваю лидокаин с этанолом в такой концентрации, чтоб не зашкаливала оптическая плотность, как в моих предыдущих попытках. В идеале она лежит в диапазоне [0,2-0,7]. Далее его сливаю в кювету №2. Прогоняю в качестве исследуемого образца.Получаю максимум с определенной Л (длиной волны) и А (опт.плотностью).
3. Повторяю пункт 2 несколько раз, каждый прогон - новый пробный раствор лидокаин-этанол.
4. Строю график А=f(C). Получаю уравнение зависимости. Определяю Е.
5. Иду в обратную сторону: ставлю образец раствора с искомой концентрацией. Устанавливаю найденную Лмах. Определяю при этой Лмах А для анализируемого образца. Нахожу его концентрацию по формуле С = А/(Е*l)
Всё верно? Поправьте, пожалуйста, меня, если я где-то ошиблась.

И дополнительные вопросы:
1) У меня же несколько пробных растворов (пункт 3). У них могут немного, но отличаться Лмах. Брать среднее значение, когда уже найду Е и пойду считать искомую концентрацию (пункт 5)?
2) Если выйдет так, что для каждой Лмах величина А не будет лежать в диапазоне [0,2-0,7] насколько это плохо? Потому что сегодня с крайне маленькой концентрацией (около 0,005%, на фото 0,01% - не обращайте внимания - не стала переименовывать) у меня получилась следующая картина:


Как видите, А огромная. В литературе есть один способ:



По сути ведь можно его попробовать использовать в нахождении концентрации, если А > 1?

[Nathalie]

Но это всё по рабоче-крестьянски, а спецы-аналитики могут дать профессиональные уточнения.

Да мне хоть как-нибудь, а по-простому - на пальцах - ещё лучше.
Никогда раньше с УФ-спектрофотометром не работала и не интересовалась этим. А нынче 2 недели уже бьюсь. И понимаю, что мои вопросы и ошибки-то глупейшие. Столько литературы просмотрела, столько книжек перебрала - а не идет анализ. Этот форум, как я уже говорила - моя последняя надежда

[alien308]

По видимому у вашего прибора довольно низкий динамический диапазон по оптической плотности, то есть плотность повыше - сразу зашкал. Поэтому лучше работать при оптической плотности около 1, как и рекомендовано. Не знаю вашего прибора и методики, но обычно помогает сделать щели пошире, без особого фанатизма: шире щели - хуже выполняется закон Бугера. Но обычно на широченных ультрафиолетовых полосах ничего страшного не бывает. Ещё можно уменьшить скорость сканирования и соответственно увеличить постоянную времени.

[alien308]

Для вашего прибора с текущими настройками и используемой кюветы 0,005% слишком много, может быть большая ошибка, а может не быть. Какая толщина кювет? Если возможно попробуйте кюветы потоньше. Или уменьшите концентрацию. Попробуйте в ряду 0.0005%, 0.001%, 0.002%. Спирт и прочие реактивы конечно при таких концентрациях целевого вещества должны быть достаточно чистыми. Ультрафиолетовые полосы поглощения часто бывают очень сильными, поэтому приходится работать с тонкими кюветами и низкими концентрациями.

[alien308]

Начните с самого простого. Постройте график оптическая плотность от концентрации. И определите по нему концентрацию в контрольных растворах. Как начнёт получаться потихоньку придёт понимание.

[chaus]

То есть мой алгоритм действий будет следующим:
1. Кювету №1 с чистым растворителем (этанолом) прогоняю в качестве нулевого образца.
2. Смешиваю лидокаин с этанолом в такой концентрации, чтоб не зашкаливала оптическая плотность, как в моих предыдущих попытках. В идеале она лежит в диапазоне [0,2-0,7]. Далее его сливаю в кювету №2. Прогоняю в качестве исследуемого образца.Получаю максимум с определенной Л (длиной волны) и А (опт.плотностью).
3. Повторяю пункт 2 несколько раз, каждый прогон - новый пробный раствор лидокаин-этанол.
4. Строю график А=f(C). Получаю уравнение зависимости. Определяю Е.
5. Иду в обратную сторону: ставлю образец раствора с искомой концентрацией. Устанавливаю найденную Лмах. Определяю при этой Лмах А для анализируемого образца. Нахожу его концентрацию по формуле С = А/(Е*l)
Всё верно? Поправьте, пожалуйста, меня, если я где-то ошиблась.

Да, в общих чертах так, если прибор однолучевой.

1) У меня же несколько пробных растворов (пункт 3). У них могут немного, но отличаться Лмах. Брать среднее значение, когда уже найду Е и пойду считать искомую концентрацию (пункт 5)?

Если вещество не взаимодействует заметно с растворителем, то Лмах при разных концентрациях не должна отклоняться больше, чем на допустимую погрешность прибора. Если появляется систематическая зависимость Лмах от С, надо взять другой растворитель -- инертный по отношению к веществу.

2) Если выйдет так, что для каждой Лмах величина А не будет лежать в диапазоне [0,2-0,7] насколько это плохо? Потому что сегодня с крайне маленькой концентрацией (около 0,005%, на фото 0,01% - не обращайте внимания - не стала переименовывать) у меня получилась следующая картина

Ну при А>2 там у Вас пропускание около 0.6%. Я не знаю, какая у Вашего прибора погрешность по измерению пропускания, но, допустим, 0.5%. Выходит, что измеряемая величина и её погрешность -- одного порядка...

[alien308]

На вашем графике из-за шумов при слишком высокой оптической плотности определён ложный максмум на 208нм. Для определения максимума используйте пробы с оптической плотностью в районе 0.7-1.4 и определив не меняйте её в ходе анализа.