Новости химической науки > Круговые РНК: кольцо, которое живёт дольше

Аннотация. Циркулярные РНК (circRNA) представляют собой ковалентно замкнутые одноцепочечные молекулы, лишённые свободных 5′- и 3′-концов, что делает их устойчивыми к экзонуклеазной деградации и обеспечивает длительную экспрессию белков. Благодаря этой стабильности circRNA рассматриваются как перспективная альтернатива линейным мРНК в вакцинах против рака, терапии белковых дефицитов и редактировании РНК. В отличие от линейных мРНК, циркулярные молекулы не требуют нуклеозидных модификаций для снижения иммуногенности, что упрощает производство и повышает биосовместимость. Клинические испытания circRNA-вакцин против меланомы уже демонстрируют мощный Т-клеточный ответ и синергию с ингибиторами контрольных точек. Несмотря на сохраняющиеся вызовы — масштабируемость, очистку от линейных примесей и тканеспецифичную доставку — циркулярные РНК входят в клиническую практику как новая платформа точной медицины.

Линейные мРНК, используемые в вакцинах против COVID-19, произвели революцию в медицине, но их применение ограничено низкой стабильностью: свободные концы молекулы быстро атакуются экзонуклеазами, а период полужизни в клетке измеряется часами. Циркулярные РНК решают эту проблему принципиально иначе — их ковалентно замкнутая структура не имеет концов, которые можно было бы «откусить».

Природные circRNA образуются в результате обратного сплайсинга (back-splicing), при котором 5′-донорный сайт сплайсинга соединяется с 3′-акцепторным сайтом нижележащего экзона. Этот процесс создаёт замкнутую петлю через 3′–5′-фосфодиэфирную связь. В отличие от линейного сплайсинга, который производит молекулы с определёнными 5′- и 3′-концами, обратный сплайсинг даёт структуру без свободных концов.

Циркулярные РНК широко распространены в клетках эукариот, эволюционно консервативны и обладают тканеспецифичными паттернами экспрессии. Они выполняют разнообразные биологические функции: действуют как «губки» для микроРНК, связывают РНК-связывающие белки, регулируют транскрипцию и даже могут кодировать белки при наличии внутренней рибосомной точки входа (IRES) или m⁶A-модификаций.

Интересно, что некоторые природные circRNA кодируют пептиды, которые могут служить неоантигенами в опухолях. Исследования показывают, что неканоническая трансляция опухолеспецифичных циркулярных РНК генерирует криптические пептиды, способные вызывать эффективный противоопухолевый иммунитет. Это открывает новые возможности для создания вакцин на основе circRNA-производных неоантигенов.

Получение терапевтических circRNA in vitro требует дополнительных этапов циклизации и очистки, которые должны быть тщательно оптимизированы для достижения высокого качества продукта и низкой иммуностимулирующей активности. Основные подходы включают химическую лигацию, ферментативную лигацию и рибозим-опосредованный самосплайсинг.

Химические методы циклизации недавно совершили прорыв, позволив синтезировать длинные РНК-конструкции от 35 до 4000 нуклеотидов. В отличие от ферментативных стратегий, которые требуют 5′-фосфатных и 3′-гидроксильных концов, химическая лигация допускает более широкий спектр терминальных функциональных групп. Однако ключевое ограничение — образующаяся связь не является природной фосфодиэфирной, что может влиять на структуру и функцию молекулы.

Наиболее перспективной считается PIE-стратегия (permuted intron-exon), использующая самосплайсирующиеся интроны группы I или II в качестве рибозимов для катализа обратного сплайсинга. Группа II индуцирует циклизацию экзонов через двухстадийную трансэтерификацию без введения GTP, обеспечивая высокоэффективный обратный сплайсинг in vitro.

Независимо от метода циклизации, процесс сопровождается накоплением остаточных линейных РНК-предшественников, которые могут запускать врождённый иммунный ответ через распознавание цитозольными РНК-сенсорами. Поэтому тщательная очистка циклизованного продукта критически важна для терапевтического потенциала инженерных circRNA.

Применяются два основных подхода. Первый использует РНКазу R — 3′–5′-экзорибонуклеазу, которая преимущественно деградирует линейные РНК, оставляя циркулярные структуры интактными. Однако длительное воздействие фермента может внести ники в circRNA, компрометируя структурную целостность. Второй подход основан на разделении по размеру: полиакриламидный гель-электрофорез (PAGE) и высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) позволяют получать препараты circRNA с чистотой выше 90%.

Циркулярные РНК обладают уникальными молекулярными свойствами, обеспечивающими значительный терапевтический потенциал. Их ковалентно замкнутая структура приводит к удлинённому периоду полужизни по сравнению с линейными РНК. Кроме того, правильно очищенные IVT-circRNA демонстрируют сниженную врождённую иммуногенность относительно линейных мРНК, что может быть преимуществом в определённых терапевтических контекстах.

Исследования на моделях фиброза печени показали, что немодифицированные circRNA обладают большей стабильностью и обеспечивают более длительный терапевтический эффект, чем модифицированные мРНК. В эксперименте с circRNA, кодирующей релаксин-2, препарат демонстрировал более медленное снижение экспрессии белка как в сыворотке, так и в различных тканях, при этом не вызывая повреждения печени или почек.

Одно из наиболее перспективных применений циркулярных РНК — противоопухолевые вакцины. В исследовании на модели меланомы B16F10

style="color:#019DC6; text-decoration:none;">circRNA-вакцина, кодирующая неоантигены, индуцировала мощный противоопухолевый эффект путём ремоделирования микроокружения опухоли, усиления функциональности моноцитов/макрофагов и активации Т- и NK-клеточных ответов.

Комбинация circRNA-вакцины с блокадой контрольных точек (анти-TIGIT и анти-PD-1) значительно подавляла рост опухоли у мышей и более эффективно стимулировала активацию Т-клеток по сравнению с монотерапией. Эти результаты подчёркивают важность подбора иммунных контрольных точек в комбинации с неоантигенными circRNA-вакцинами.

Малые циркулярные РНК-вакцины, кодирующие антигены, при загрузке в липидные наночастицы вызывают потентные и длительные Т-клеточные ответы после подкожной инъекции мышам. Относительно больших линейных мРНК, малые circRNA-вакцины индуцировали до 10-кратного увеличения антиген-специфичных Т-клеток и составляли 30–75% от общего числа периферических CD8+ Т-клеток в течение 6 месяцев.

Липидные наночастицы (LNP) стали наиболее продвинутой и широко используемой платформой для доставки нуклеиновых кислот, что было наглядно продемонстрировано в мРНК-вакцинах против COVID-19. Структурно LNP состоят из четырёх компонентов: ионизируемых липидов, фосфолипидов, холестерина и ПЭГилированных липидов. Ионизируемые липиды остаются нейтральными при физиологическом pH, минимизируя неспецифические взаимодействия с РНК, но быстро протонируются в кислой среде эндосом, способствуя мембранному слиянию и высвобождению РНК.

Для таргетной доставки circRNA разрабатываются подходы с включением лигандов или антител в состав LNP. В одном из исследований системное введение circRNA с использованием cRGD-таргетированных LNP обеспечивало преимущественное накопление в опухолевой области. В комбинации с внутримышечной неоантигенной РНК-вакциной этот подход приводил к выраженному подавлению опухоли как в гетеротопических, так и в ортотопических моделях.

Несмотря на впечатляющие преимущества, циркулярные РНК-вакцины находятся на ранней стадии разработки. Сохраняются серьёзные вызовы в оптимизации последовательностей, масштабируемом производстве, таргетной доставке и строгой валидации in vivo. Ключевые проблемы включают удаление линейных РНК-примесей, которые могут активировать врождённый иммунный ответ, и повышение эффективности трансляции.

Китайский исследователь Чэнь Линлин, ведущий специалист в области циркулярных РНК, выделяет четыре направления для преодоления барьеров: совершенствование производства и анализа, оптимизация LNP-технологий, разработка систем таргетной доставки следующего поколения и интеграция ИИ со структурной биологией для рационального дизайна сложных трёхмерных РНК-структур.

К концу 2024 — началу 2025 годов китайские биотехнологические компании Ribox Pharmaceuticals и CirCode Biotech получили разрешения на проведение клинических исследований (IND) от FDA США и NMPA Китая, что подчёркивает трансляционный потенциал circRNA-терапий.

Циркулярные РНК представляют собой новую веху в развитии РНК-терапии. Их уникальная замкнутая структура обеспечивает стабильность, недостижимую для линейных мРНК, а низкая иммуногенность позволяет обходиться без сложных нуклеозидных модификаций. Вакцины на основе circRNA уже демонстрируют мощный противоопухолевый эффект в доклинических моделях, а первые клинические испытания открывают путь к их широкому применению.

По мере совершенствования технологий синтеза, очистки и доставки циркулярные РНК могут стать основой для следующего поколения вакцин, терапии белковых дефицитов и инструментов редактирования генома. Кольцо, которое живёт дольше линии, — это не просто красивая метафора, а реальная терапевтическая стратегия, входящая в клиническую практику.

Перепечатка статьи разрешается при условии размещения активной гиперссылки на ChemPort.Ru

Перепечатка статьи разрешается при условии размещения активной гиперссылки на ChemPort.Ru