Выделение аминопептидазы

[Kolyuchii.exe]

В качестве дипломного проекта я выбрал ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОЙСТВ АМИНОПЕПТИДАЗЫ. Суть в том, что в разных буферах (ацетатном и фосфатном) она работает по разному. Если кто в курсах, подскажите тонкости выделения и очистки. Особый респект за подсказку механизма её действия в разных буферах.

[pumatnv]

Посмотрите информацию в PabMed
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi
Кое-что там даже можно скачать бесплатно. Там такого добра должно быть много

[Kolyuchii.exe]

Хм, а с высаливанием не подскажите. Конкретно меня интересует сколько грамм печени на какой объём буфера. Чтобы при последущем высаливании в последней пробирке осталось хоть сколько осадка.
Высаливал сульфатом амония. Концентрацию сульфата менял через 2%, от 10% до 30%. В последней пробирке осадка не оказалось, видимо из-за низкой концентрации гомогената или черезмерно маленького числа шага высаливания.
Спасибо!

[Kolyuchii.exe]

или вот задача: нет рефрежераторной центрифуги на 150 000 же, а надо. возможно ли, путём простого добавления хлорида магния к растворимым фракциям белков, осадить их (белки) при же, несколько меньшим, т.е. как у меня?

[avor]

или вот задача: нет рефрежераторной центрифуги на 150 000 же, а надо. возможно ли, путём простого добавления хлорида магния к растворимым фракциям белков, осадить их (белки) при же, несколько меньшим, т.е. как у меня?

Нет! (Дело не в рефрежераторности а в том что это ультрафуга.)

--Несколько других g
Любая другая фуга больше 25000-30000 не даст, а этого не хватит.

Высаливал сульфатом амония. Концентрацию сульфата менял через 2%, от 10% до 30%.

Во первых это можно делать в однм объеме подсыпая сухой порошок к раствору и каждый раз откручивая осадок.

Во вторых вы активность фермента замеряли во фракциях. Возможно ваш фермент не в последней фракции. И еще если в методике написано высаливание 30% СА то это значит брали экстракт и доводили до 30%, а дальше работали с осадком.
Дело в том что при таком осаждении высаливаются и другие белки которые могут служить соосадителем для вашего.

[Kolyuchii.exe]

Само сабой, что работал с одним объёмом, но осадок-то тоже удалять надо. Это в прошлом. Тут другое назрело. После солюбилизации мембранных белков 1% Тритоном определение белка на спектрофотометре оказалось невозможным предположительно из-за высокой концентрации тритона. Если так, то какой метод определения общего белка предпочтительнее. Желательно что нить из доступного типа Бредфорд или Лоури, но буду благодарен за всё!

[avor]

Само сабой, что работал с одним объёмом, но осадок-то тоже удалять надо. Это в прошлом. Тут другое назрело. После солюбилизации мембранных белков 1% Тритоном определение белка на спектрофотометре оказалось невозможным предположительно из-за высокой концентрации тритона. Если так, то какой метод определения общего белка предпочтительнее. Желательно что нить из доступного типа Бредфорд или Лоури, но буду благодарен за всё!

Брыдфорд! Лоури не подходит ибо взаимодействует с тритоном.
От тритона можно избавится при осаждении ТХУК(5-15%)(трихлоруксусной кислотой) белок в осадке, тритон в супере.

[Kolyuchii.exe]

А я слышал, что тритон ещё изоамиловым спиртом экстрагируется, а потом хлороформом.

Осваиваю нингидриновую реакцию. Бредфорд слишком нервный на белки. Ну его...