краун-эфиры для удаления натрия и калия

[avatar]

Здравствуйте.

Есть мысль для удаления катионов металлов из раствора пептидов (белков) для масс-спектрометрии использовать краун-эфиры.

Возможно ли это? Не будут ли краун-эфиры необратимо цепляться к пептидам или белкам?

Возможно ли краун-эфиры посадить на смолу без потери их свойств?

[SkydiVAR]

Лучше использовать ионообменные смолы как таковые. Или электроосмос, например...

[chemist]

Если краун-эфиры полимер-связанные (Sigma-Aldrich, например, продают), то катионы металлов они засорбируют, каждый свой. Это, конечно, гораздо мягче, чем иониты, которые могут вызвать денатурацию нежных белков.

[avor]

Смолы? На полистирольные и полифенольные смолы пептиды необратимо липнут - мама не горюй.

--Есть мысль для удаления катионов металлов из раствора пептидов (белков) для масс-спектрометрии использовать краун-эфиры.

Белки можно тупо диализовать против деионизованной воды. Только надо помнить, что часто из стекла в воду поступает ионов металлов количество сравнимое в молярном отношении с количеством полипептида.

--Возможно ли краун-эфиры посадить на смолу без потери их свойств?
Да не вапрос! Только белкам это мало поможет. Белки на классические крауны должны липнуть, ибо классические крауны - гидрофобные.

[chemist]

--Возможно ли краун-эфиры посадить на смолу без потери их свойств?
Да не вапрос! Только белкам это мало поможет. Белки на классические крауны должны липнуть, ибо классические крауны - гидрофобные.

Классические, это циклические олигомеры этиленгликоля (18-краун-6, 15-краун-5 и т.п.)? Они хорошо растворимы в воде, т.е. гидрофильны. С белками, конечно, могут совокупиться, но скорее за счёт полярных взаимодействий.

[avatar]

avor писал
Белки можно тупо диализовать против деионизованной воды.

поскольку доступа к диализатоу не имею, не знаю что и ответить .

при пробоподготовке использую центрифужные концентраторы 5кДа.
по идее, при добавлении краун-эфиров, даже не на смоле, произойдёт связывание ими ионов металлов, а затем эти комплексы при фильтровании уйдут в фильтрат.

вопрос в том, будет ли так на самом деле?

и ещё, какие крун-эфиры образуют с ионами натрия наиболее прочные комплексы?

[avor]

это циклические олигомеры этиленгликоля.
Не только. Это не чистый циклический ПЭГ, В противном случае их невозможно было бы использовать в межфазном катализе.
--Они хорошо растворимы в воде.
Спирт тоже хорошо растворим в воде, однако белки в его растворах денатурируют агрегируют и выпадают в оадок. Аналогино ПАВ они хоть ирастворимы в воде, их нельзя назвать гидрофильными и белки вяжут мама не горюй.
-- С белками, конечно, могут совокупиться, но скорее за счёт полярных взаимодействий.
Нет, они будут вести себя наиболее похоже с ПАВ.

[avor]

--поскольку доступа к диализатоу не имею, не знаю что и ответить .
Поверьте, это не дорогое удовольствие.

--при пробоподготовке использую центрифужные концентраторы 5кДа.
Это практически и есть диализ. Та же фишка - вид сбоку.

-вопрос в том, будет ли так на самом деле?

Скорее нет, чем да. К тому же легче проверить, чем предсказать.

Я вам рекомендую следущую методу.

1) Сначала вытеснить катионы с белка. Добавлением солей аммония или триса или триэтаноламина. Например 0.2-0.5М хлоридов, или ацетатов. Следите за рН оно должно быть таким, что бы белок не попадал в осадок, типа 7. Инкубировать белочек в этих солях минут 5-10. Потом фильтровать(концентрировать) через картридж, потом опять развести в растворе той же соли и фильтровать и так пару раз(с концентрированием раз в 10.
2) Потом развести деионизованной водой(Mili Q, Super Q) и концентрировать и разводить водой циклов 5(или больше, думаю 10 циклов это уже перебор). ВСЕ!

[avatar]

1) Сначала вытеснить катионы с белка. Добавлением солей аммония или триса или триэтаноламина. Например 0.2-0.5М хлоридов, или ацетатов. Следите за рН оно должно быть таким, что бы белок не попадал в осадок, типа 7. Инкубировать белочек в этих солях минут 5-10. Потом фильтровать(концентрировать) через картридж, потом опять развести в растворе той же соли и фильтровать и так пару раз(с концентрированием раз в 10.2) Потом развести деионизованной водой(Mili Q, Super Q) и концентрировать и разводить водой циклов 5(или больше, думаю 10 циклов это уже перебор). ВСЕ!

я так понимаю, если проводить трипсинолиз, то рН раствора держать около 8, тогда шаг 2 делать не нужно?

[avor]

я так понимаю, если проводить трипсинолиз, то рН раствора держать около 8, тогда шаг 2 делать не нужно?

Нифига не понял. Что из его следует? Где трипсинолиз, где шаг 2? При чем тут рН трипситнолиза и шаг 2?

[avatar]

я так понимаю, если проводить трипсинолиз, то рН раствора держать около 8, тогда шаг 2 делать не нужно?

Нифига не понял. Что из его следует? Где трипсинолиз, где шаг 2? При чем тут рН трипситнолиза и шаг 2?

Звиняйте

Я имел ввиду, что если проводить трипсинолиз после промывки солями аммония, то разводить деионизированной водой не следует, поскольку трипсин работает при рН около 8, а после воды столько не будет.

[avor]

Да, наверное, так лучше. Хотя трипсин на самом деле плюс минус 2 еденицы еще работает, правда не на всю активность. А деионка обычно 5.5-5.9

[chemist]

Я вам рекомендую следущую методу.
1) Сначала вытеснить катионы с белка. Добавлением солей аммония или триса или триэтаноламина.

У меня, как у химика-органика, в данном месте сводит скулы (извините ). рКа Na+-иона = 14.8, рКа NH4+-иона = 9.24, т.е. разница в 5 порядков!!! Вы всерьёз думаете, что катионы аммония (любого замещения) смогут вытеснить катионы щелочных металлов (про многовалентные даже и не говорю)? И потом, нужны реактивы бешенной чистоты по металлам, тем более, что они добавляются в огромных количествах и привнесут в белок металлов намного больше, чем было до того как.

произойдёт связывание ими ионов металлов, а затем эти комплексы при фильтровании уйдут в фильтрат.

Эти комплексы растворимы в воде ещё лучше, чем исходные крауны, т.к. более полярны и к тому же гидратированы.

Идеальными нейтральными сорбентами для удаления микропримесей металлов из биоматериалов являются полимер-связанные криптофиксы, но они очень дороги, стоит ли овчинка выделки?

[avor]

У меня, как у химика-органика, в данном месте сводит скулы (извините ). рКа Na+-иона = 14.8, рКа NH4+-иона = 9.24, т.е. разница в 5 порядков!!! Вы всерьёз думаете, что катионы аммония (любого замещения) смогут вытеснить катионы щелочных металлов (про многовалентные даже и не говорю)? И потом, нужны реактивы бешенной чистоты по металлам, тем более, что они добавляются в огромных количествах и привнесут в белок металлов намного больше, чем было до того как.

Рекомендую не спешить и прежде чем давать эмоциональные оценки, до конца и тщательно продумывать свои утверждения.
Вот при чем здесь константы диссоциации сопряженных кислот? Или вы хотите намекнуть, что концентрация ионов аммония в растворе всегда будет в миллион раз меньше, чем натрия при одинаковых концентрациях их солей. Да, нет, не всегда! Ваше утверждение справедливо только для растворов гидроокисей. Рекомендую взять учебник и на досуге посчитать концентрацию ионов аммония в 1М хлориде. Более того, вы путаетесь в показаниях, полагая, что 2х валентные катионы будут удерживаться лучше, хотя их рКа, как правило меньше рКа натрия. Так и какие же константы нам нужны для справедливой оценки?(Вовсе не кислотно основной диссоциации) Нам нужны константы связывания соответствующих ионов с белком. А их то мы конечно не знаем, но из общих соображений( констант связывания данных катионов с ацетатом) можно предположить, что они вряд ли отличаются более чем на 2 порядка, при чем в данном случае в пользу катионов производных аммония в силу их большего объема. (да, кстати, здесь утверждение о лучшем удерживании двух валентных катионов становится справедливым).

Теперь о самом процессе замещения. Вы видимо не уловили, ибо в прямую это не говорилось, а подразумевалось по умолчанию, но процесс построен на ултрафильтрации. Белок как бы промывается на фильтре. Для аналогии предлагаю такую модель: пусть у вас есть ионообменная смола с карбоксиметильными катионообменными группами, она находится в натриевой форме. Вы кидаете ее на фильтр и начинаете промывать раствором, в котором концентрация, допустим ионов аммония, в миллион раз больше концентрации ионов натрия. Уловили суть? После этого вы начинаете промывать эту смолу уже просто сверхчистой водой. ОК!?

-- И потом, нужны реактивы бешенной чистоты по металлам, тем более, что они добавляются в огромных количествах и привнесут в белок металлов намного больше, чем было до того как.

Совершенно точно, действительно реактивы нужны максимально чистые, я даже упомянул о том, что даже от стекла будет фон, поэтому пластик и кварц в данном случае предпочтительнее.
Правда, не надо передергиваний, мы не знаем, что там было до того как.

Что касается сильно связанных с белком катионов-кофакторов, находящихся во всяких там реакционных центрах и порфириновых кольцах - это уже другая история. При чем далеко не всегда необходимо их удаление для масс-спектров

[chemist]

Коллега avor, Вы заядлый спорщик
1. В кислотно-основных равновесиях (в них входит и ионный обмен) положение равновесия контроллируется рКа конкурирующих кислот (или рКb оснований) во всех водных средах независимо от рН и организации потоков (реактор смешения, вытеснения, ультрафильтрация и т.д.), об этом и пишется в учебниках. Если эти положения отбросить, то "из общий соображений" приходим к справочнику Стеля (потолок), в которм написано всё что угодно, включая разницу всего в 2 порядка, которая Вам и приглянулась (лично мне приглянулась разница в 7 порядков)
2. Поливалентные ионы связываются крепче с полиэлектролитами потому, что у них многоцентровое взаимодействие, в отличие от одновалентных. Вы сначала говорите, что это неправильно, а в конце абзаца - что справедливо. А на самом деле-то как по-Вашему?
3. Катион аммония (NH4+) не намного больше катионов щелочных металлов, да и с чего бы ему, если размер атомов водорода (протонов) ничтожен.
4. Константы связывания катионов с белком, конечно, отличаются от таковых для катионитов (как и между разными катионитами), но соотношение констант Металл+/Амин+ при переходе от одного сорбента к другому примерно сохраняется, если, конечно, амин не какая-нибудь каракатица, которая не сможет пролезть в микропору. ТРИС, судя по всему, пролазит далеко не во все, особенно гидрофобные полости белков, и если там засел катион металла, то собака не выроет крота
5. Если Na+-форму катионита окучивать раствром NH4+ с целью вытеснить Na+ до ppm, то понадобится тонна аммония на 100 г катионита, а натрий всё равно весь не вымоется (останется в гиброфобных полостях, которых хоть и мало, но значительно бальше ppm).
6. Что я передёрнул относительно требований к чистоте реактивов по металлам, если собираемся их тщательно удалять, я не понял

Можно, конечно, металлы вывести солями гуанидина (рКа 13.5), но понравится ли это нативной белковой конституции?

[avor]

Вы пишите быстрее чем думаете. Подумайте еще. Сейчас вам отвечать бессмысленно. Вы по сути повторили все что уже писали

[chemist]

Вы пишите быстрее чем думаете. Подумайте еще. Сейчас вам отвечать бессмысленно. Вы по сути повторили все что уже писали

У меня был почти час на обдумывание Вашего хода, до цейтнота ещё далеко

[avor]

Мне нечего сказать, вы меня просто то ли игнорируете, то ли не желаете понять. Так что дальнейшее общение не имеет смысла

[chemist]

Главное чтобы топикстартер понял как применить крауны для удаления металлов из своих белков, остальное - издержки образования субъектов

[EvgeniyChup]

А если попробовать не краун а криптанд??? и провести сидементацию белка в градиенте концентраций хлорида стронция?