Новости химической науки > Экспресс-тест обнаружит ДНК вируса без ПЦР

Исследователи хотят разработать методы обнаружения вирусных ДНК, не основанные на применении и полимеразо-цепной реакции (ПЦР).

Конечно же, ПЦР обеспечивает исключительную амплификацию нуклеиновых кислот, но для ее проведения требуется время и, самое главное, оборудование, которым не могут похвастаться многие лечебные учреждения, в особенности – в развивающихся странах. Идеальным вариантом для оперативной диагностики был бы экспресс-тест.

Одной из наиболее перспективных альтернатив ПЦР является рекомбиназная полимеразная амплификация [recombinase polymerase amplification (RPA), РПА], обеспечивающая умножение генетического материала менее чем за 15 минут. К сожалению, этот метод нельзя использовать на свежеотобранном, «сыром» образце крови. В новой работе специалисты по биоинженерии сообщают о разработке простого метода предварительной обработки образцов, который заключается в отделении ДНК вируса от образца крови; этот метод делает диагностику, основанную на технологии RPA, ближе к практике.

Биоинженеры концентрируют ДНК, поиск которой происходит, на полоске бумаги из нитроцеллюлозы. При перемещении образца крови по бумаге иммобилизованные нуклеотиды (красные) связывают целевую последовательность (зеленую). Другие ДНК (желтые) вымываются. (Рисунок из Anal. Chem. 2015, DOI: 10.1021/ac504365v)

Метод ПЦР основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи ферментов в условиях in vitro. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, как правило, с высокой точностью. Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий – денатурации ДНК, ее отжига и элонгации.

Для того чтобы избежать применения специализированного оборудования и сократить время на анализ, Бриттани Рорман (Brittany Rohrman) с коллегами решили модифицировать метод РПА, при реализации которого умножение генетической информации происходит при стационарной температуре. Эта возможность достигается за счет того, что помимо ферментов-полимераз в процессе амплификации генетической информации здесь участвуют ферменты-рекомбиназы. Большая простота оформления метода РПА позволит использовать его для экспресс-диагностики – в перспективе, если бы удалось научить РПА «работать с сырой кровью», результаты анализа можно будет получить через 15-20 минут после отбора крови у пациента.

Рорман решила выяснить, почему протокол РПА не работает с образцами крови, не прошедшими предварительную подготовку. Она предположила, что причиной является высокая концентрация «посторонних» ДНК в образце крови, а то, что разбавленный образец крови вполне мог быть проанализирован методом РПА, только подкрепило ее догадки. На первом этапе работы Рорман определила точную концентрацию ДНК, при которой метод РПА прекращает работать.

На втором этапе Рорман разработала простой метод удаления фоновых ДНК из образца крови. Она поместила образец на одном конце полоски бумаги из нитроцеллюлозы (подобный бумажный носитель используется в экспресс-тестах на беременность). При перемещении образца крови по бумаге иммобилизованные нуклеотиды связывают целевую последовательность ДНК, позволяя сконцентрировать ее для последующего анализа.

Рорман испытала новую систему на растворе, имитирующем кровь человека – в качестве целевой ДНК раствор содержал плазмиду ВИЧ, фоновый «шум» был представлен спермой лосося. По словам исследователя, метод работает, однако пока еще состоит из большого числа стадий, и полный анализ (от взятия образца крови) занимает слишком много времени – стадия обогащения образца на нитроцеллюлозной бумаге занимает 50 минут, а сама процедура РПА – 15 минут. В планах Рорман и коллег объединение обеих операций в рамках одного микрокапиллярного устройства.

Источник: Anal. Chem. 2015, DOI: 10.1021/ac504365v

метки статьи: #аналитическая химия, #биохимия, #медицинская химия