Новости химической науки > сенсорная система для киназ

Киназы играют важную роль в передаче различных сигналов в клетке. Этих энзимов очень много, а для детального изучения клеточных сигнальных путей важно знать вклад индивидуальных киназ в эти сигнальные процессы. На данном этапе развития науки это нетривиальная задача.

Профессор Дэвид Лауренс (David S. Lawrence)

предложил использовать систему, состоящую из пептида, имеющего в своей цепочке остаток тирозина (который подвергается фосфорилированию киназой) и флуорофор (8, рис 2), меняющий свои оптические свойства в зависимости от полярности среды.

Рис 1. Упрощёная схема сенсорной системы.

Фосфорилированый пептид (9, рис. 2) также будет субстратом для белков, которые в нормальных условиях распознают белки с фосфорилированым тирозином (на этом в частности основана передача клеточных сигналов, например, так называемая SH2 область белка специфически связывается с некоторыми полипетидными последовательностями имеющими фосфорилированый тирозин). В случае синтетического пептидного субстрата, после его связывания с белком-мишенью, имеется вероятность, что флуорофор окажется в малополярной области белка-мишени, что повлияет на его оптические свойства. В конечном итоге наблюдаемое изменение флуоресценции позволит судить об активности киназы (рис. 2).

Рис 2. Химические превращения, происходящие в сенсорной системе.

Была синтезирована библиотека пептидов (рис. 3), содержащих один из трех флуорофоров. Кроме того, флуорофор сочетался с двумя разными аминокислотами в пептидной цепи: (L)-2,3-димаминопропионовой (Dap) или (L)-2,4-диаминобутановой (Dab). Эта аминокислота заменяла соответствующую аминокислоту в позициях +1, +2, +3 или +4 в полипептидной цепи, показаной на рис. 3 внизу.

Рис 3. Синтезированая библиотека пептидов.

Затем синтезированые пептиды были инкубированы с белками Src-киназой и Lck-SH2-белком (белок-мишень) и АТФ. Два пептида со структурой 13 и 14 (рис. 4, нумерация источника) обладали наибольшим изменением интенсивности флуоресценции (до 4х порядков величины) в этих условиях. Интересно также, что, при добавлении фосфотазы (энзима, гидолизирующего фосфотирозин), флуоресценция возвращалась к своему первоначальному состоянию.

Рис 4. Пептиды, вызывавшие наибольшее изменение флуоресценции.

Авторы полагают, что варьирование структуры пептида позволит создать ряд сенсоров, фосфорилириуемых теми или иными киназами специфически, что в перспективе позволит приблизить наше понимание внутриклеточных сигнальных путей. В заключение следует отметить, что эта новая сенсорная система была испытана лишь in vitro.

Источник: J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 7684-7685