новости бизнеса
компании и предприятия
нефтехимические компании
продукция / логистика
торговый центр
ChemIndex
новости науки
работа для химиков
химические выставки
лабораторное оборудование
химические реактивы
расширенный поиск
каталог ресурсов
электронный справочник
авторефераты
форум химиков
подписка / опросы
проекты / о нас


контакты
поиск
   

главная > справочник > химическая энциклопедия:

Эксклюзионная хроматография


выберите первую букву в названии статьи: А Б В Г Д Е Ж З И К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Э Ю Я

Эксклюзионная хроматография (ситовая хроматография), жидкостная хроматография. основанная наразл. способности молекул разного размера проникать в поры неионогенного геля. который служит неподвижной фазой. Различают гель-проникающую хроматографию (элюент - орг. р-ритель) и гель-фильтрацию (элюент - вода).

Для эксклюзионной хроматографии используют макропористые неорг. или полимерные сорбенты. Для эксклюзионной хроматографии полярных полимеров неорг. сорбенты (силикагели и макропористые стекла) модифицируют кремнийорг. радикалами, а для эксклюзионной хроматографии гидрофильных полимеров -гидрофильными группами. Среди полимерных сорбентов наиб. распространены стирол-дивинилбензольные (для эксклюзионной хроматографии высокополимеров и олигомеров). Для гель-фильтрации биополимеров, прежде всего белков, используют гидрофильные полимерные сорбенты (сефадексы - декстраны с поперечными сшивками, а также полиакриламидные гели) или модифицированные полисахаридами макропористые силикагели.

Эксклюзионную хроматографию эффективно применяют при разработке новых полимеров, технол. процессов их получения, контроле произ-ва и стандартизации полимеров. Эксклюзионную хроматографию используют для анализа ММР полимеров, исследования, выделения и очистки полимеров, в т. ч. биополимеров.

При эксклюзионной хроматографии молекулы, имеющие в растворе большой размер, или совсем не проникают, или проникают только в часть пор сорбента (геля) и вымываются из колонки раньше, чем небольшие молекулы. Соотношение эффективных размеров макромолекул и пор сорбента определяет коэф. распределения Kd, от которого зависит объем удерживания компонента VR в колонке:

где V0 - объем пространства между частицами сорбента, Vp -объем пор сорбента.

Эффективным размером макромолекулы при эксклюзионной хроматографии является ее гидродинамич. радиус R, который вместе с мол. массой полимера М определяет характеристич. вязкость полимера . Универсальную калибровочную зависимость VR от произведения (уравнение 2) впервые получил экспериментально Г. Бенуа, она имеет вид (рис. 1):

где А и В - константы. Уравнение (2) одинаково справедливо для линейных и разветвленных полимеров, блок- и привитых сополимеров. олигомеров. Используя уравнение Марка-Куна-Хувинка: где и а - табулированные константы, учитывающие взаимод. полимера с растворителем и степень жесткости макромолекулы, можно перейти от универсальной зависимости (2) к рабочей зависимости (3) для исследуемого образца (рис. 2):

где С2 = B(a+1).

Рис. 1. Универсальная калибровочная зависимость Бенуа для эксклюзионной хроматографии. - линейный полистирол. - разветвленный полистирол. (+) -звездообразный полистирол. - гетеропривитой сополимер полистирол. и полиметилметакрилата. - полиметилметакрилат; - разветвленный полифенилсилоксан; -полибутадиен.

С др. стороны, получив экспериментально зависимость (2) с использованием полимерных стандартов (не менее 3 образцов), для которых известны М, и а, а также зависимость (3) для полимера с неизвестными константами, можно найти для него , а и константы С1 и С2. Можно определять зависимость (3) и непосредственно путем калибровки узкодисперсными (с известными М)и широкодисперсными (с известным ММР) стандартами. Располагая эксклюзионной хроматограммой и калибровочной зависимостью определяют ММР исследуемого полимера.

Рис. 2. Рабочая калибровочная зависимость для эксклюзионной хроматографии.

В области от V0до VT (объем колонки, доступный для растворителя и молекул ниже определенного размера, соответствующего Ммин) рабочая зависимость имеет линейный (квазилинейный) характер. Соответствующие объемам V0 и VT мол. массы представляют собой пределы исключения - Ммакс (молекулы большого размера, не проникают в поры сорбента) и Ммин, (молекулы небольшие, полностью проникают в поры сорбента). Эти величины, а также тангенс угла наклона линейной части калибровочной зависимости селективности разделения С2 = Vp/lg(Mмакс/Mмин)и степень ее линейности определяют качество сорбента для эксклюзионная хроматография Благодаря логарифмич. зависимости V от М селективность разделения dV/dM падает с увеличением М, поскольку С2 = (dV/dM)M. Для разделения макромолекул с близкими М требуется сорбент, работающий в узком диапазоне М и обладающий высокой селективностью С2. Сорбенты с порами одного размера теоретически способны разделять макромолекулы в пределах коммерческие сорбенты характеризуются . Ддя разделения макромолекул в большом диапазоне М нужны сорбенты с бимодальным и тримодальным распределением пор по размерам, обеспечивающие линейную мол.-массовую калибровочную зависимость в диапазоне М = 102,5 - 106,5. Селективность С2 подобного сорбента (или специально подобранной смеси сорбентов) естественно ниже, чем унимодального сорбента, но ее делают максимальной для заданного диапазона Макс. селективность достигается увеличением объема перового пространства сорбента, у бимодального и тримодального сорбентов, кроме того,-оптимальным распределением пор по размерам. Важно, чтобы при разделении смеси макромолекул их наибольшая и наименьшая М находились в пределах ММИН - ММАКС характерных для данного сорбента. Иначе по краям хроматограммы при VT и V0будут выходить из колонки макромолекулы соотв. с М ММИНи М ММАКС, образуя ложные хроматографич. пики.

Механизм эксклюзионной хроматографии Макромолекулы в растворе представляют собой статистич. ансамбль (статистич. клубок). Их распределение между пористым сорбентом и раствором контролируется изменением энергии Гиббса при переходе макромолекулы из раствора в поры: где - изменение энтальпии макромолекулы вследствие взаимод. ее сегментов с поверхностью сорбента (матрицей геля.; - уменьшение энтропии при переходе макромолекулы из раствора в поры; Т - абс. т-ра. Разделение макромолекул происходит в эксклюзионном режиме, когда , a Kd, зависящий от соотношения размеров макромолекул и пор, меньше 1.

В критич. условиях, когда при переходе макромолекул из раствора в поры сорбента энергия Гиббса не изменяется происходит полная компенсация потери энтропии макромолекулы благодаря увеличению энтальпии: т.е. переход макромолекулы из раствора в поры энергетически безразличен. При >0 и Kd> 1 наблюдается адсорбционная хроматография. В критич. условиях все макромолекулы, независимо от М, имеют Kd= 1 и, не разделяясь, выходят из колонки при VR = VТ В эксклюзионной области при макромолекулы с большей М сильнее вытесняются из пор, т. к. их энтропия при переходе из раствора в поры уменьшается в большей степени.

На рис. 3 показаны кривые зависимости от энергии взаимод. сегментов макромолекулы (см. Макромолекула) с поверхностью сорбента. Эти кривые для макромолекул с разным числом сегментов (N)пересекаются в точке критич. энергии Кривые левее точки относятся к режиму эксклюзионной хроматографии. Отсюда ясно, что эксклюзионная хроматография включает значит. область энергетич. зависимостей где имеет значения от до Чем меньше тем больше изменение при попадании макромолекулы в поры и, следовательно, разделение макромолекулы более селективно.

Рис. 3. Зависимость и для разных N(N1 >N2>N3).

Гетерополимеры (сополимеры, функциональные олигомеры) можно анализировать как с помощью эксклюзионной хроматографии (когда у всех компонентов ), так и в условиях, когда у одного из компонентов В этих (критических) условиях указанный компонент представляет хроматографич. "невидимку" (его Kd не зависит от М). Последнее позволяет по законам эксклюзионной хроматографии анализировать ММР отдельных блоков блок-сополимера, ММР функциональных олигомеров (отдельно для каждого типа функциональности), а вблизи критич. условий получать с помощью эксклюзионной хроматографии ММР олигомеров для каждого типа функциональности.

У макромолекул, несущих электрич. заряд (полиэлектролитов), наблюдаются схожие, но более сильные изменения в зависимости от рН и ионной силы элюента, Это происходит благодаря увеличению размеров молекул полиэлектролитов при их диссоциации и проявлению кулоновских взаимод. между зарядами на больших расстояниях, чем в случае действия дисперсионных или электростатич. сил. При увеличении рН выше 4 поверхность силикагелей приобретает отрицательный заряд. Взаимод. с ней нейтральной макромолекулы остается эксклюзионным (режим эксклюзионной хроматографии), поликатион адсорбируется благодаря ионообменной сорбции, а полианион исключается из пор по законам ионной эксклюзии значительно сильнее, чем при обычной эксклюзии.

Для подавления нежелательных для эксклюзионной хроматографии явлений ионной эксклюзии и ионообменной сорбции модифицируют поверхность сорбентов (для придания ей нейтрального заряда при рН > 4), увеличивают ионную силу р-рителя, ослабляя кулоновские взаимод., добавляют орг. растворители, смещая тем самым рК полиэлектролита или изоэлектрич. точку у полиамфолитов. С др. стороны, ионообменную сорбцию и ионную эксклюзию можно использовать для разделения нейтральных макромолекул, полианионов и поликатионов одного размера. Поскольку диссоциация полиэлектролитов увеличивается с разбавлением их растворов, то при эксклюзионная хроматография макромолекулы на краях хроматографич. колонки, где их концентрация мала, диссоциируют и движутся по колонке не по законам эксклюзионная хроматография, а по законам ионообменной сорбции и ионной эксклюзии в зависимости от заряда поверхности сорбента и макромолекулы, что приводит к искажению формы кривой зависимости V и М (рис. 4), а также позволяет диагностировать наличие того или другого процесса.

Рис. 4. Эксклюзионная хроматография нейтральных макромолекул (а) и полиэлектролитов: ионная эксклюзия (б), ионообменная сорбция (в).

Эффекты, аналогичные ионообменной сорбции, но только в более слабой степени, могут наблюдаться при гидрофобных взаимод. макромолекулярных сегментов с модифицированной гидрофобными радикалами поверхностью сорбента или при электростатич. взаимод. поверхностных силанольных гидроксигрупп с функциональными группами полярных макромолекул. Все эти эффекты должны подавляться при проведении эксклюзионной хроматографии

Техника эксклюзионной хроматографии Для разделения макромолекул в режиме эксклюзионная хроматография используют колонки двух типов: работающие в узком = 102 и широком ( = 104 — 105 диапазонах. Колонки широкого диапазона M имеют широкое распределение пор сорбента по размерам (бимодальное, тримодальное). Это распределение подбирается т. обр., чтобы при заданных степени линейности калибровочной мол.-массовой зависимости и диапазона масс обеспечивалась наиб. степень селективности С2. Можно также составлять колонки для широкого диапазона М из колонок первого типа.

Разные типы полимеров требуют спец. растворителей для эксклюзионной хроматографии наиб. универсальный растворитель - ТГФ (для эксклюзионная хроматография полибутадиена, полистирола, полиметакрилата, полиакрилатов). ТГФ имеет низкую вязкость, однако требует очистки от пероксидов. Толуол, хлороформ и метилэтилкетон также широко используют в эксклюзионная хроматография полимеров. Для эксклюзионной и олиолефинов применяют о-дихлорбензол и 1,2,4-трихлорбензол, а для полиакрилонитрила, полиэфиров и полиамидов - м-крезол, фторированные спирты и кислоты.

Калибровку колонок в диапазоне масс 5 х 102- 1,5 х 107 осуществляют с помощью стандартных узкодисперсных полистирол.в. Выпускают также стандарты полиметилметакрилата. полиизопрена, полиэтилена, полиэтиленгликоля и биополимеров (декстран и др.).

Эксклюзионная хроматография осуществляется с помощью хроматографа, детектором служит спектрофотометр или проточный рефрактометр с предельной чувствительностью 5 х 10-8 ед. рефракции, что соответствует концентрации полимера 5-10-5 %. Обычно прибор работает при комнатной т-ре, однако эксклюзионная хроматография полиолефинов требует повышенной температуры, что способствует увеличению селективности разделения, эффективности колонок и скорости анализа вследствие уменьшения вязкости подвижной фазы. Совр. хроматографы комплектуются автоматич. устройством для приготовления (растворение полимера, фильтрация р-ра) и ввода пробы, компьютером для интерпретации результатов анализа ММР. Концентрацию пробы (с) следует уменьшать с ростом М полимера: для полимера с М 104 с = 0,25 % по массе, 3 х 104 - 2 х 104 с = 0,1%, 4 х 105 - 2 х 106 с = 0,05%, М>2 х 106с = 0,01%.

Применение комбинации рефрактометрич. детектора и детектора многоуглового рассеяния света - фотометра позволяет определять ММР и индексы разветвленности без калибровки хроматографа по полимерным стандартам.

Эксклюзионную хроматографию применяют для исследования и выделения полимеров в диапазоне М 102 - 2 х 107. Наилучшая селективность достигнута для олигомеров - выделяют олигомергомологи с числом звеньев до 10-15. Особенность эксклюзионной хроматографии олигомеров состоит в том, что на хроматограмме выходят пики для каждого из олигомергомологов, присутствующих в олигомере. Поэтому можно определять ММР олигомера без калибровки колонок, если известна М одного или неск. олигомергомологов.

При гель-фильтрации белков необходимо принимать меры для предотвращения их адсорбции на сорбенте и не допускать их денатурации. В отличие от эксклюзионной хроматографии синтетич. полимеров и олигомеров, используемой гл. обр. в аналит. целях, гель-фильтрация белков - один из важнейших способов их выделения и очистки. Разрешение белков по М при гель-фильтрации ниже, чем при гель-проникающей хроматографии синтетич. полимеров, т.к. для белков R М 1/3, а для гибкоцепных полимеров R М 1/2. Можно повысить чувствительность определения М белков методом гель-фильтрации, если проводить ее в условиях денатурации: в о М растворе гуанидинхлорида (R ~ М 1/2) или в растворе додецилсульфоната Na (R ~ M).

Гель-фильтрацию открыли в 1959 Д. Порат и П. Флодин, которые показали возможность фракционирования водорастворимых макромолекул, в т. ч. белков, по мол. массе, в качестве сорбента они использовали сшитый декстрановый гель. В 1964 Д. Мур предложил с помощью гель-проникающей хроматографии определять ММР полимеров, фракционируя их на стирол-дивинилбензольном геле.

Лит.: Беленький Б.Г., Виленчик Л. 3., Хроматография полимеров, М., 1978; Нефедов П. П., Лавренко П. Н., Транспортные методы в аналитической химии полимеров, Л., 1979; Энтелис С.Г., Евреинов В. В., Кузаев А. И., Реакционноспособные олигомеры, М., 1985; Yau W.W., Kirkland J., Bly D., Modern size-exclusion liquid chromatog, raphy, N.Y., 1979; Belenkii B.G., Vilenchik L.Z., Modem liquid chromatognphy of macromolecules, Amst., 1983.

© Б. Г. Беленький.




выберите первую букву в названии статьи: А Б В Г Д Е Ж З И К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Э Ю Я


Все новости



Новости компаний

Все новости


© ChemPort.Ru, MMII-MMXVII
Контактная информация